细胞培养精品课件

1、关于细胞培养第一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月第一章 绪论及基本理论知识第一节 绪论一、组织培养基本概念从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。第二张，PPT共四十六页，创作于2022年6月第三张，PPT共四十六页，创作于2022年6月二、对组织培养的评价长时间观察活细胞便于记录细胞种类广泛便于各种不同测试方法与体内相同的基因组易于实验研究性价比高生物制品主要的手段第四张，PPT共四十六页，创作于2022年6月三、组织培养发展简史第五张，PPT共四十六页，创作于2022年6月1907，Harrison 悬滴培养法，取

2、蛙胚一片组织，采用成蛙淋巴做培养基，能存活一周。1910，Burrows 用鸡血浆作为鸡胚组织的支持和营养物质。比淋巴好，能使神经组织、心脏组织及皮肤生长良好。Burrows和Carrel 成功培养了成年狗、猫、小鼠、豚鼠以及恶性组织的外植物。此外，证明传代可延长细胞的寿命。同时，若把胚胎提取液与血浆混合使用，存活的更好。Carrel（外科大夫） 发明卡式培养瓶W.H.Lewis和M.R.Lewis 发展出许多合成培养基1929，Fell 组织培养我国始于20世纪30年代第六张，PPT共四十六页，创作于2022年6月第二节 组织培养细胞生物学细胞生长指细胞体积增大;细胞增殖是细胞数量增多。一、

3、体内外细胞的差异增殖使细胞数量增多,分化使机体结构和功能多样化。此间每个细胞的生命活动,均听命于外源信号,通过相关基因的调控,使之发生增殖或分化的表达。当细胞被离体培养后,信号来源切断,特定基因分化表达减弱或停止，而进化中保守的细胞增殖活动却可维持，遂使体内外细胞出现了差异，这种差异从细胞离体培养的刹那就开始了。第七张，PPT共四十六页，创作于2022年6月二、培养细胞的分化1.不适应:细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显2.脱分化或去分化：即细胞失掉发生分化的能力。 不适应是因生存条件的改变使分化发生阻抑;从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致，因此应分析体外培养细胞分化的改变属何种性

4、质。很多细胞在培养中的改变只是因培养环境的改变和分化因子的缺乏，导致细胞分化表达受阻、分化基因表达抑制或不充分而已。即便是脱分化也并不意味着细胞分化能力完全丧失。第八张，PPT共四十六页，创作于2022年6月三、培养细胞形态分类 1.贴附型 ：只赖于贴附才能生长的细胞称贴附性细胞或锚着依存性细胞。当细胞贴附在支持物上之后,易失去它们在体内时原有的特征,细胞分化现象常变得不显著。在形态上常表现单一化的现象,并常反映其胚层起源,呈现类似前述“反祖现象”。如来源于内、外胚层的细胞多呈上皮型;来自中胚层的则易呈成纤维细胞型,显然与细胞分化有关。由于上述原因,体外培养细胞形态常表现有一般化的倾向。因此在

5、判定培养细胞形态时,很难再按体内细胞标准确定。 第九张，PPT共四十六页，创作于2022年6月a.成纤维型细胞:本型细胞形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名;细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起。细胞在生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走行。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等呈本类形态。 第十张，PPT共四十六页，创作于2022年6月b.上皮型细胞:本型细胞具有扁平不规则多角形,中有圆形核,细胞紧密相连成单层膜。起源于内、外胚层细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮等组织培养时,皆呈上皮

6、型形态。上皮型细胞生长时,尤其是外胚层起源的细胞,细胞之间常出现所谓“拉网”,即在构成上皮膜状生长的细胞群中一些细胞常相互分离卷曲,致使上皮细胞膜中形成网眼状空洞。拉网的形成可能与细胞分泌透明质酸酶有关。第十一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月c.游走型细胞: 本型细胞在支持物上散在生长，一般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快而且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞相区别。d.多形型细胞: 除上述三型细胞外，还有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定它们规律的形态，可统归入多形型细胞。第十二张，PPT共四十六页，创作于2022年6月第十

7、三张，PPT共四十六页，创作于2022年6月2. 悬浮型 有的细胞在培养时不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，如某些癌细胞和血液白细胞可呈悬浮型。细胞悬浮生长时，胞体为圆形，观察时不如贴附型方便。其优点是细胞悬浮在培养液中生长，生存空间大，容许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢等研究。 第十四张，PPT共四十六页，创作于2022年6月四、培养细胞形态结构1.大体形态：悬浮生长：胞体基本呈圆形贴附于支持物：开始为圆形,很快经形态演变过渡扁平形态。附于球体表面时,细胞与球体呈同心圆,支持物表面平坦时,则细胞先由圆形延展成圆饼形,此时的细胞可称之为放射延展细胞,其细胞质可区分为:中心区或内质

8、外质或板层区:活跃与不活跃部分。放射延展细胞持续0.5-2h过渡为极性细胞。当细胞相互接壤成片后,极性常变得不明显,外质周边部也无明显活跃部分与不活跃部分的区别。第十五张，PPT共四十六页，创作于2022年6月第十六张，PPT共四十六页，创作于2022年6月2.超微结构:电镜观察细胞膜分为三层结构，双层类脂分子组成；细胞膜向外凸出形成微绒毛；即使细胞连接成片时，在细胞之间仍存在着一定的间隙；细胞相互接触部并可见到桥粒，桥粒的有无可作为识别上皮细胞的标志；细胞膜表面常附有由细胞分泌物形成的糖蛋白膜，即细胞外衣，它对细胞的运动，尤其对细胞贴附于支持物生长有很大作用；微丝存在于细胞膜下面的胞质区膜下

9、皮质层；细胞质中的其它结构如线粒体、内质网、高尔基氏复合体、中心体和溶酶体等多集中在细胞内质第十七张，PPT共四十六页，创作于2022年6月3.细胞骨架观察(CSL):细胞骨架(微丝和微管)是细胞质中重要结构之一,与细胞运动以及细胞转化有密切关系。鬼笔环肽显示微丝蛋白染色法：(1)盖片培养细胞(70%-80%汇合),PBS洗3次;(2)2%的甲醛/PBS液(甲醛按37%)固定3min;(3)0.5%三硝基甲苯/PBS处理3次,每次10min,PBS洗3次;(4)用罗丹明标记的鬼笔环肽(1:10)室温中反15min,PBS洗3次;(5)60%甘油十荧光防淬剂封片,荧光显微镜检。第十八张，PPT共

10、四十六页，创作于2022年6月抗管蛋白免疫染色法:微管主要成分为管蛋白 (1)支持物培养法,培养在盖片上,PBS中洗330s;(2)3%甲醛液固定20min,PBS洗31min,吸干多余PBS;(3)冷丙酮(-10-20),令细胞面向上,作用7min, PBS中洗31min,吸干多余的PBS;(4)直径6cm碟皿,中央滴浓度为0.1-0.2mg/ml的一级抗管蛋白抗体,细胞面向下,置37温箱中45min至1h(5)令盖片浮在PBS液面,用镊子挟出,PBS洗，(6)二级荧光抗体处理:按(4)进行,漂洗(7)封片,荧光显微镜下观察。第十九张，PPT共四十六页，创作于2022年6月第二十张，PPT共

11、四十六页，创作于2022年6月考马斯亮蓝:(1)支持物盖片培养,戊二醛固定15min,蒸馏水漂洗；(2)考马斯亮蓝液中染色60min,漂洗；(3)分化:置入含甲醇冰醋酸液中,微丝逐渐明显,终止;(4)漂洗，脱水，各度酒精，二甲苯，树胶封片。细胞内微丝呈蓝色,如分化较好时背地清亮,反之会影响微丝的清晰度。第二十一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月五、组织培养细胞的生长和增殖过程1.组织培养细胞生命期：是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。细胞生存过程中经历以下三个阶段：a.原代培养期:也称初代培养,即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段,一般持续1-4周。此期细胞呈活跃的移动,可见细胞

12、分裂,但不旺盛。细胞群是异质的,也即各细胞的遗传性状互不相同,细胞相互依存性强,由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大,是检测药物很好的实验对象。第二十二张，PPT共四十六页，创作于2022年6月b.传代期:初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛。并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代30-50次后，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。第二十三张，PPT共四十六页，创作于2022年6月c.衰退期: 此期细胞仍然生存,但增殖很慢或不增

13、殖;细胞形态轮廓增强,最后衰退凋亡。在少数情况下,以上三期任何一点，由子某种因素的影响，细胞可能发生自发转化，转化的标志之一是细胞可获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体,细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。第二十四张，PPT共四十六页，创作于2022年6月第二十五张，PPT共四十六页，创作于2022年6月2.组织培养细胞一代生存期 所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，如某一细胞系为第1

14、53代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增不同;在细胞一代中，细胞能倍增3-6次。细胞传一代后，一般要经过三个阶段。第二十六张，PPT共四十六页，创作于2022年6月a.潜伏期:先经过悬浮期,此时细胞胞质回缩,胞体呈圆球形。接着是贴壁,悬浮期结束。细胞贴附支持物后,除先经过前述延展过程变成极性细胞,还要经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时,可有运动活动,基本无增殖,少见分裂相。初代培养细胞潜伏期长,约24-96小时或更长,连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短,仅6-24小时;细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时,标志细胞已进入指数增生期。第二十七

15、张，PPT共四十六页，创作于2022年6月b.指数增生期:细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数(MI)表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%,初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%-5%(肿瘤细胞偏高)。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实脸最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3-5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。第二十八张，PPT共四十六页，创作于2022年6月第二十九张，PPT共四十六页，创作于2022年6

16、月c.停滞期:细胞数量达饱和密度后,细胞停止增殖,进入停滞期,此时细胞数量持平,故称平顶期。停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动,继而培养液中营养渐趋耗尽,代谢产物积累、pH降低。此时需传代,否则细胞会中毒,发生形态改变,重则从底物脱落死亡,故传代应越早越好。传代过晚(已有中毒迹象)能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下,虽进行了传代,因细胞已受损,需要恢复,至少还要再传1-2两代,通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后,才能再用。第三十张，PPT共四十六页，创作于2022年6月第三十一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月生长曲线测定：接种21孔/24孔板细胞,分7组,每组3孔

17、,培养一周(7天),期间逐日检测一组,计数,最后把7天中的细胞数值绘成图,即为细胞生长曲线。(1)悬液制备 (2)接种(3)计数检测 (4)绘图:用座标图纸绘成生长曲线第三十二张，PPT共四十六页，创作于2022年6月细胞分裂指数(MI):待取得逐日分裂相数值后，也可绘成细胞分裂指数曲线。注意，细抱分裂指数曲线与生长曲线趋势基本一致，但不完全相同，如当细胞增长达饱合密度并进入停止期后，细胞数值很大，而分裂相可完全消失。第三十三张，PPT共四十六页，创作于2022年6月接种存活率和克隆形成率:2-5个细胞/cm2被接种到底物上,贴壁并能存活生长形成细胞小群的细胞百分数值称接种存活率,用以表示细胞

18、群的活力。由于检测接种存活率时是借观察克隆(通常为16-50个细胞)形成情况,又因每个克隆都来自一个细胞,因此也称克隆形成率。细胞接种存活率与细胞活力成正比，第三十四张，PPT共四十六页，创作于2022年6月六、培养细胞增殖动力学1.增殖态：增殖态即细胞进行增殖的状态或过程;细胞增殖或自我复制的手段为细胞有丝分裂。细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制;两者是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。只有在两者完成后，细胞才能发生分裂;而细胞有丝分裂所完成的主要是细胞质和细胞核的分配。以上三个基本过程是细胞增殖态主要的活动，三个过程有阶段性，又相互依存。第三十五张，PPT共四十六页，创作于202

19、2年6月a.G1期:细胞分裂后期,或DNA合成前期,G1期是细胞质复制的主要阶段,细胞进入G1期标志细胞已进入增殖态。上一次细胞分裂后所形成的子细胞是否能进入G1期,取决于外源生长因子和其它增殖相关因子的调控。在G1期中,接受外界因子影响的特定阶段,称调节点。培养细胞属旺盛增殖细胞群体,一般具有较短的G1期,衰退细胞持续时间长。G1期主要为细胞内的蛋白质合成、RNA合成、多聚核蛋白体合成增多等;G1期胞体逐渐增大,是镜下唯一可感知的变化。第三十六张，PPT共四十六页，创作于2022年6月b.S期：即DNA合成期,主要机能活动为进行DNA合成。各种细胞DNA合成持续时间差别不大,比较恒定,平均6

20、-8h,除用抑制DNA合成药物如5-氟尿嘧啶等外,细胞一旦进入S期,DNA合成过程一经开始,大多能持续进行,独立性较大,对环境不利因素有一定耐受能力。但DNA在进行合成时,多核苷酸双链发生分离,在此阶段,易受致突变或致癌因素作用,DNA合成期是遗传物质易受致突变物损伤的时期。第三十七张，PPT共四十六页，创作于2022年6月c.G2期:发生在DNA合成后和本次细胞分裂期之前，故也称DNA合成后期或细胞分裂前期。细胞进入G2期后，DNA含量已加倍，具有4倍量的DNA。在G2期主要的变化是与细胞分裂相关的RNA的合成和染色质的螺旋化。本期持续时间较短，平均2-5小时。G2期对外界环境敏感，易受温度

21、、pH及各种其它因素的影响而受阻不能进入M期，但不利作用消除后却能很快恢复。第三十八张，PPT共四十六页，创作于2022年6月d.M期:即细胞有丝分裂期，培养细胞分裂仍以有丝分裂方式进行增殖。M期结束形成两个子细胞，是细胞增殖周期的终结期。处于分裂中的细胞叫分裂相，在生活状态下可以直接观察到，培养细胞是研究细胞有丝分裂过程理想的对象，细胞分裂过程分前中后末四期，活细胞分裂过程表现如下:第三十九张，PPT共四十六页，创作于2022年6月 前期:细胞核发生转动可能是前期的开始。当染色体在核中出现并愈来愈清楚时,证明细胞已进入分裂前期。稍后,核膜和核仁突然解体消失,染色体混于细胞质中并呈现活跃的运动

22、。同时从细胞膜表面向外伸出很多长短不等的突起,它们此起彼伏犹如液面沸腾。此时细胞质逐渐回缩,细胞体趋于变圆,遂与底物附着面减少,易脱落入培养液中,染色体由分散状态渐向细胞中央部移动,然后突然“冻结”于赤道平面,到此前期结束,中期开始,前期持续时间20-30分钟。第四十张，PPT共四十六页，创作于2022年6月中期:胞质进一步回缩,胞体呈圆球形,与支持物附着面缩小达极限。如于此时摇动培养瓶壁,在培养液的冲击下,细胞极易从瓶壁脱落,依此可作为收集中期分裂相的简易方法。染色体集中于赤道平面后,失去明显的运动,中期染色体集聚在赤道平面上称中期板。细胞分裂中期持续20-30分钟min,本期细胞对外界因素敏感,易受外界因素如秋水仙素作用发生阻滞、延缓或停止向后期过渡。第四十一张，PPT共四十六页，创作于2