溶血磷脂酸对嗅鞘细胞形态增殖及表达脑源性神经营养因子的影响

1、溶血磷脂酸对嗅鞘细胞形态增殖及表达脑源性神经营养因子的影响【关键词】溶血磷脂酸嗅鞘细胞Keyrds：lysphsphatidiaid;lfatryensheathingells;rphlgy;prliferatin;brain-derivedneurtrpifatr1材料和方法1.1材料1.2方法1.2.3Es的鉴定利用Es的特异性标志物p75作细胞免疫荧光染色进展鉴定。用40gL的多聚甲醛固定30in，0.01lL的PBS冲洗3次，加50g/L的牛血清白蛋白封闭液封闭60in后，参加兔抗p75抗体(1200)4孵育过夜，0.01lL的PBS冲洗3次，参加FIT标记的由羊抗兔IgG(1200)

2、37孵育1h，0.01lL的PBS冲洗3次。对照实验将一抗用0.01lL的PBS代替，其余步骤同上，结果为阴性。对p75呈阳性反响的细胞鉴定为Es。Es纯度通过随机选取200倍视野，分别于明场下计数细胞总数及荧光视野下计数阳性细胞数，并计算出二者阳性细胞的平均比例。1.2.4LPA的稀释和实验分组LPA的稀释按照文献7的方法进展。以下操作均按照培养液中LPA的浓度的不同分为5个实验组：1L、5L、10L、20L、50L组。对照组培养液中参加含10g/L无脂肪酸牛血清白蛋白的PBS。1.2.6TT检测LPA干预后Es的增殖活力纯化的Es以1104l的密度接种到左旋多聚赖氨酸包被的96孔培养板中，

3、每孔100l，培养48h后，弃去培养液，用DEF-12洗涤3次，更换为N2培养基，继续培养24h。再用各浓度的LPA干预，每组24孔。分别在LPA干预后12、24、36、48、60、72、84、96h，每组取3孔各参加10l的TT，作用浓度为5gL，继续培养4h后，弃上清，每孔参加100l的DS，待蓝色结晶溶解后用酶链免疫检测仪测定D值(检测波长为490n)，绘制细胞生长曲线，对照组亦按一样方式处理。1.2.8统计学处理采用SPSS11.5统计学软件进展分析，数据以(s)表示，做样本均数t检验或者单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.2TT检测结果结果显示，LPA促进Es增殖

4、呈现时间和浓度依赖性：干预后12h各实验组与对照组D值比拟差异无统计学意义(P0.05);10L组发挥促增殖作用最快，干预后24h即高于对照组(P0.01);3696h各浓度LPA均能显著促进增殖，与对照组比拟差异有统计学意义(P0.01)；各实验组均在LPA干预后60h到达增殖顶峰，与之前时间点比拟差异有统计学意义(P0.05)，之后进入平台期，而对照组各时间点的D值差异无统计学意义(P0.05)；干预后12h10L组D值与其他实验组比拟差异无统计学意义(P0.05)，干预后24h高于1、50L组(P0.05)，3696h均高于其他实验组(P0.05)。见表2。2.3esternBlt检测结

5、果结果显示，LPA干预后60h各实验组BDNF的表达量均高于对照组(P0.01)，1、5、10、20L组BDNF表达量差异无统计学意义(P0.05)，而50L组BDNF表达量低于其他实验组(P0.05)。见图5。3讨论LPA促细胞增殖的机制主要是通过Gi/蛋白激活Ras下游的丝裂原活化蛋白激酶，引起细胞增殖。LPA发挥促增殖作用的浓度较广，从0.01L9到50L10的LPA都具有促进细胞增殖的作用。Yan等11只是研究了05L的LPA对Es的促增殖作用，发现LPA发挥促增殖作用的最低浓度为0.1L，1L时作用最大。本实验观察到，150L的LPA均能促进增殖，浓度低于10L时促增殖作用随浓度升高

6、呈递增趋势，而高于此浓度促增殖作用随浓度升高呈下降趋势。这种浓度依赖性可能与LPA受体有关。与细胞增殖有关的LPA受体主要有3种，分别为LPA13受体，这些受体广泛分布在Es及多种类型的细胞中。LPA1、LPA2为高亲合力受体。LPA3为低亲合力受体。LPA与受体结合时，首先与LPA1、LPA2结合，当其结合位点被占据后才与LPA3结合。尽管这3种受体都能激活APK，但它们的作用并非一致12。当LPA与LPA1、LPA2结合时，那么表现出促增殖抗凋亡作用，而与LPA3结合时，那么传递促凋亡信号13。因此，当LPA到达一定浓度后，LPA将与LPA3受体结合，细胞增殖受到抑制。Es能表达并分泌BD

7、NF。LPA可能通过下述机制上调Es表达BDNF：通过Gq蛋白偶联受体激活磷脂酶，经磷酸肌醇循环，促进细胞内钙发动，随后钙通道孔径发生改变，又使细胞外钙离子内流，引起胞内钙程度上升14，进而激活BDNF基因启动子P、P15，16。本实验观察到，150L的LPA较对照组均显著上调了BDNF的表达，但当浓度升高到50L时BDNF的表达较其他浓度明显下降。BDNF表达下降的原因可能与细胞内钙离子程度过高引起钙超载有关。研究说明，LPA的促钙离子内流作用具有浓度依赖性，超过一定剂量可引起细胞内钙超载17。另外，BDNF本身也可导致细胞内钙离子程度升高，甚至可以到达诱发细胞去极化的程度18。由于Es本身也存在BDNF的受体，因此Es可受到自分泌BDNF的影响而发生钙超载。钙超载发生后那么引起细胞一系列的功能障碍，最终导致Es表达BDNF下降。值得注意的是，虽然LPA可通过Gi/蛋白偶联受体途径促进Es增殖，但近来研究说明BDN