酪丝亮肽对人肝癌BEL7402细胞的抑制作用及对NK细胞杀伤活性的影

1、酪丝亮肽对人肝癌BEL7402细胞的抑制作用及对NK细胞杀伤活性的影【摘要】目的研究三肽化合物酪丝亮肽tyrserleutide，YSL对人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤的抑制作用及对自然杀伤细胞NK细胞杀伤活性的影响。方法建立人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤模型，观察YSL对肿瘤生长的抑制作用；采用四甲基偶氮唑蓝TT法检测YSL对正常小鼠及人肝癌BEL7402荷瘤鼠的NK细胞杀伤活性的影响。结果YSL160g/kgd能抑制BEL7402的生长，肿瘤抑制率为72.23%，且能增强BEL7402荷瘤裸鼠及正常小鼠NK细胞杀伤活性，与生理盐水组相比均具有显著性差异P0.05。结论YSL对人肝癌BEL7

2、402裸鼠移植瘤有抑制作用，并具有增强正常及荷瘤小鼠NK细胞杀伤肿瘤细胞活性的作用。【关键词】酪氨酸丝氨酸亮氨酸小鼠裸肿瘤实验性肝肿瘤杀伤细胞天然InhibitiveEffetfTripeptideTyrserleutidYSLnHuanHepatellulararinaBEL7402ellsandItsEffetntheAtivityfNKellAbstrat:PurpseTinvestigatetheinhibitiveeffetftripeptidetyrserleutideYSLnhuanhepatellulararinaBEL7402transplantedturinnudeiean

3、ditseffetntheativityfnaturalkillerells(NKell).ethdsHuanhepatellulararinaBEL7402transplantedturdelinnudeieasreated.TheinhibitinfYSLnturgrthasstudied.TheeffetfYSLntheativityfNKellinnralieandinnudeietransplantedithhepatellulararinaBEL7402eredetetedbyethylthiazlyltetrazliu(TT)lrietriassay.ResultsYSL160g

4、/(kgd)uldinhibitthegrthftransplantedhepatellularturBEL7402innudeie,ithturinhibitinrate72.23%,anduldenhanetheativityfNKellinnaturalieandinnudeietransplantedithhepatellulararinaBEL7402,hihallhadsignifiantdiffereneparediththentrlgrup(P0.05).nlusinsYSLhasinhibitineffetinhepatellulararinaBEL7402transplan

5、tedtur,andanenhanetheativityfNKell.Keyrds:tyrsine;serine;leuine;ie,nude;neplass,experiental;liverneplass;killerells,natural酪丝亮肽是我国自主研发的小分子多肽化合物，由三个氨基酸组成，化学构造组成为L酪氨酰L丝氨酰L亮氨酸，分子构造式为18H27N36，分子量为381.42，中国国家药典委员会批准通用名称为酪丝亮肽Tyrserleutide，YSL。YSL在前期研究结果显示出较强的抗实验性肝癌作用1,2，2022年9月中国国家药品与食品管理局SFDA批准，进入期及期临床实验

6、研究，已获得初步疗效。本课题对此化合物的抗肿瘤作用及相应机制进展初步讨论。1材料与方法1.1药品及主要试剂YSL由深圳康哲药业提供，RPIediu1640培养液购自GIB试剂公司，胎牛血清购自Hylne试剂公司，TT购自SIGA试剂公司。1.2细胞株YA1细胞株，天津医科大学免疫教研室保存。1.3实验动物安康BALB/小鼠LA即清洁动物级，雄性，68周龄，体重18g22g，购自军事医学科学院实验动物中心。安康BALB/(nu/nu)裸鼠SPF即无特定病原体动物级，雄性，45周龄，体重18g22g，与荷人肝癌BEL7402裸鼠均购自中国医学科学院肿瘤研究所动物中心。于独立换气的无特定病原体的层流

7、柜中饲养，所用饲料、垫料、饮用水均为无菌处理，严格按照NIH标准平安操作号：A38731进展。1.4YSL对正常小鼠NK细胞杀伤活性的影响3将30只安康BALB/小鼠随机分为YSL不同剂量组160g/(kgd)、80g/(kgd)、生理盐水组，每组10只，连续腹腔注射给药，每日1次，连续给药28d。于给药完毕后次日处死小鼠，无菌条件下取脾脏，常规制备脾细胞悬液，以PRI1640液调整细胞浓度为4106个/l，将已到达对数生长期的YA1细胞制成1105/l4，于96孔细胞培养板中参加各组小鼠脾细胞悬液100l/孔和细胞培养基100l/孔，作为效应细胞孔，设3个复孔；加YA1细胞100l/孔和培养

8、基100l/孔，作为靶细胞孔，设2个复孔；加YA1细胞100l/孔和各组小鼠脾细胞悬液100l/孔，作为实验孔，设3个复孔。将加好样品的96孔培养板，置于37、5%二氧化碳孵箱中培养4h后用TT法检测NK细胞杀伤活性。按以下公式计算NK细胞杀伤率：NK细胞杀伤率(%)=1-(实验细胞孔D值-效应细胞孔D值)/靶细胞孔D值100%。1.5YSL对人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤的影响5选取肿瘤直径大于1，生长状态良好的荷人肝癌BEL7402裸鼠，无菌条件下将新颖的瘤组织切成243的小块，置于RPI1640培养液中，在裸鼠腹部外侧皮下剪一小口，用无钩眼科镊子将瘤块移植于皮下。将已接种肿瘤的裸鼠，随机

9、分为生理盐水组(每日0.2l/只)、YSL不同剂量组160g/(kgd)、80g/(kgd)，每组10只。各组药物分别溶于0.2l生理盐水中，于肿瘤接种后次日，经腹腔注射，每日1次，连续给药60d。于给药完毕后次日，逐只剖取肿瘤，称量、记录瘤重，并检查肿瘤有无坏死感染等情况。用游标卡尺测量肿瘤的3个互相垂直的直径，代入下式计算：V=(1/6)AB。V为肿瘤体积，A、B、为瘤体的3个直径。计算肿瘤抑制率=(对照组平均瘤重实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重100%。1.6YSL对BEL7402荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响4无菌条件下取1.5中各组小鼠脾脏，用TT法检测YSL对BEL7402荷瘤裸鼠

10、NK细胞杀伤活性的影响，实验步骤同1.4。1.7统计学方法使用SPSS统计软件，各组资料采用方差分析，两两比拟采用leastsignifiantdiffereneLSD检验，以0.05为有显著性差异。2结果2.1YSL对正常小鼠NK细胞杀伤活性的影响YSL剂量为160g/(kgd)及80g/(kgd)时可以增强正常小鼠NK细胞杀伤活性，剂量为160g/(kgd)时与生理盐水组比拟具有显著性差异P0.05，结果见表1。2.2YSL对人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤的影响YSL剂量为160g/(kgd)时可以抑制人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤的生长，与生理盐水比拟具有显著性差异(P0.05)，肿瘤抑

11、制率为72.23%。YSL剂量为80g/(kgd)时对BEL7402有一定的抑制作用，抑制率为53.69%，但与生理盐水组比拟无显著性差异(P0.05)，结果见表2。2.3YSL对BEL7402荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响YSL剂量为160g/(kgd)时可以增强人肝癌BEL7402荷瘤裸鼠NK细胞的杀伤活性，与生理盐水组比拟有显著性差异P0.05，结果见表3。3讨论原发性肝胆癌症的发病及致死率很高5。大约90%成人原发性肝癌为肝细胞癌6，故本课题采用BEL7402人肝细胞肝癌细胞株制备裸鼠移植瘤模型展开研究，结果显示YSL可以显著抑制人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤的生长，给药剂量为160g

12、/(kgd)与80g/(kgd)时，抑瘤率分别为72.23%、53.69%。目前多肽类药物的抗肿瘤作用，正在引起专家学者们的广泛重视7，如4个氨基酸的小肽Tuftsin在体情况下可以抑制肝癌、胃癌、黑色素瘤和裸鼠胆管癌的生长8；从肝素结合细胞因子HGP中链区域合成的五肽或六肽，表现出抗肿瘤细胞增殖的作用，在播散早期应用还能抑制肝转移的发生9。YSL是一种新型短肽类抗肿瘤药物，其抗肿瘤作用机制尚不非常清楚。肿瘤的发生和开展与机体免疫功能具有非常亲密的关系。免疫力低下的人群肿瘤发生率高，恶性肿瘤发生后又能产生免疫抑制因子抑制宿主的免疫功能10,11。小分子肽类药物可以作用于机体的免疫系统，充分调动

13、机体自身免疫系统的主动性，发挥抗肿瘤作用12,13。机体的抗肿瘤免疫学机制非常复杂，其中由T淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞介导的细胞免疫，在抗肿瘤免疫中起主要作用14。NK细胞杀伤肿瘤细胞不受H限制，也不需预先与抗原接触或显示任何记忆反响。NK细胞对肿瘤的杀伤优势表现为直接溶解和分泌细胞因子两个方面，其杀伤肿瘤既可通过穿孔素又可通过Fas配基。NK细胞可以产生TNF、IFN和IL1，这些细胞因子在NK细胞抗癌反响中有非常重要地位15。本研究证实，YSL可以增强正常小鼠NK细胞对肿瘤细胞的非特异性杀伤活性，抑制人肝癌BEL7402裸鼠移植瘤的生长，同时增强人肝癌BEL7402荷瘤裸鼠NK细胞的杀伤

14、活性。裸鼠是一种先天无胸腺或仅有胸腺残迹或异常上皮的免疫缺陷动物。T细胞不能正常分化，缺乏成熟T细胞的辅助、抑制系杀伤功能，细胞免疫力低下，其体内非依赖T细胞免疫机制如NK及巨噬细胞具有较高活性16。因此，YSL可能是通过增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤才能来抑制肿瘤的增殖。【参考文献】1傅正,陆融,李国立,等.酪丝亮肽对人肝癌BEL7402细胞钙稳态影响的实验研究J.中国科学辑:生命科学,2022,35(3)262-268.2邱爽,陆融,赵岚,等.三肽化合物酪丝亮肽抗肿瘤作用及对单核巨噬细胞激活作用机制的研究J.中国肿瘤生物治疗杂志,2022,12(2):129-133.3徐叔云,卞如濂,陈修.

15、药理实验方法学.第3版.北京：人民卫生出版社,2002.1785-1786.4章元沛,苏怀德.药理学实验.第2版.北京：人民卫生出版社,1998,137-138.5韩锐.抗癌药物研究与实验技术.北京:北京医科大学中国协和医科大学结合出版社,1997.299-300.6AeriananerSiety.anerfatsfigures2022.TheAeriananerSiey，spubliatin.USA:AeriananerSietyIn.2022.7JaninYL.PeptidesithantianeruserptentialJ.AinAids,2022,25:1-40.8雷新,韩本立.Tuf

16、tsin的合成及对裸鼠胆管癌模型的作用J.第三军医大学学报,2002,22:75-77.9FazekasK,RasE,Zarandi,etal.BasiHGFlikepeptidesinhibitgeneratinfliveretastasesinurineandhuaturdelsJ.AntianerRes,2002,22:2575-2579.10aD,GuJ.IuneeffetfturinfiltratinglyphytesanditsrelatintthesurvivalfpatientsthvarianalignaniesJ.TngjiedUniv,1991,11(4):235-239

17、.11aeharaY,TisakiS,daS,etal.LyphndeetastasisandrelatintturgrthptentialandlaliunerespnseinadvanedgastrianerJ.IntJaner,1997,74(2):224-228.12KjiTerat,KEiihiKntani,Yshitzaki,etal.DexyribnuleiAid(DNA)endingapanajrhistpatibilityplexlasspeptideanalgueaugentedantigenspeifiellulariunityandsuppressiveeffetsnturgrtheliitedbyDNAvaineiuntherapyJ.anerRes,2022,63:7920-7925.13atsuzakiA,SuieA,HattriH,etal.IuntherapyithautlgusdendritiellsandturspeifisynthetipeptidesfrsynvialsaraJ.JP