沉淀反应(课件)

1、第六章沉淀反应precipitation1第一节 液体内沉淀试验 一、环状沉淀试验 二、絮状沉淀试验 三、免疫浊度测定第二节凝胶内沉淀试验 一、单向扩散试验 二、双向扩散试验第三节 免疫电泳技术 一、免疫电泳 二、火箭免疫电泳 三、对流免疫电泳 四、免疫固定电泳教学内容及目的掌握其原理与方法2沉淀反应沉淀反应（precipitation reaction） 是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象。3沉淀反应沉淀反应的特点：1、抗原是分子量比较小的可溶性物质，分散在液体中呈胶体溶液。2、反应所形成的沉淀产物主要由抗体组成。3、沉淀反应的抗原和抗体比较，分子量小、反应面

2、积大，试验时为不使抗原分子量过量，常稀释抗原。4、反应结果以抗原的稀释度判定效价。4液相沉淀反应环状沉淀试验絮状沉淀试验沉淀反应分类单向扩散试验双向扩散试验对流免疫电泳火箭免疫电泳免疫胶乳浊度测定法免疫散射浊度测定法免疫电泳免疫透射浊度测定法凝胶内沉淀反应免疫电泳技术免疫浊度分析5第一节液相内沉淀试验1、概念：指抗原抗体反在生理盐水或无机盐缓冲溶液为反应介质的液体内自由接触，短时间出现可见的沉淀反应。 2、分类（方法和沉淀现象不同）环状沉淀絮状沉淀免疫浊度法6一、环状沉淀试验原理：是一种在液体界面上进行的抗原抗体反应。当抗原和相应的抗体接触，在界面上形成清晰的乳白色的沉淀环。7 一、环状沉淀试

3、验1、原理及方法血清抗原乳白色沉淀环D=1.52mm 沉淀管2、应用：法医学中鉴定血迹、C反应蛋白的监测等3、方法评价：简便快速，但只能定性，敏 感性低，已很少使用。8二、 絮状沉淀试验絮状沉淀试验：是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。方法评价：敏感度较低、简便、受抗原抗体比例的影响非常明显应用：性病研究实验室试验（VDRL）、USR、RPR，本实验只能作为定性或半定量实验方法。91:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀释加入抗血清各管抗体量不变振摇 混匀、37 孵育沉淀量不同出现沉淀量最多的管为该抗原的最适比例管。轻摇

4、絮状沉示意图淀AgAbAg10表10-1 最适比方阵滴定法抗体稀释度抗原稀释度1/101/201/401/801/1601/3201/640对照1/5+ + + + + + + +1/10+ + + + + + + +1/20+ + + + + + +1/40+ + + + +1/80+11三、免疫浊度测定概念： 免疫浊度测定是将现代光学测量仪器与自动化分析检测系统相结合应用于沉淀反应，可对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定。12 免疫浊度测定基本原理 当可溶性抗原与相应抗体在特殊缓冲液中，在增浊剂（如PEG）的作用下，能快速形成免疫复合物微粒,使反应液变浑

5、浊。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。测定反应系统的浊度，可计算出样品中待测抗原的含量。13免疫浊度方法分类 根据试验原理及测定浊度的方法的不同免疫透射比浊法免疫散射比浊法14（一）免疫透射比浊法1、原理： 抗原与抗体在一定缓冲液中形成抗原抗体复合物（IC），当光线透过反应溶液时，由于抗原抗体复合物对光线的反射和吸收，引起透射光减少，IC越多透射光越少，可用吸光度表示。若抗体量固定，所测吸光度与复合物的量成正比，与待测抗原量成正比。用已知浓度的抗原标准品建立标准曲线，根据待测样品的吸光度可得出抗原

6、的含量。152、方法：稀释检测标本和标准抗原（5个浓度）将稀释标本和标准抗原与适当过量的抗血清混合反应在340nm处测各管吸光度（IC：35100nm，选择范围：290410nm）按相关关系公式绘制标准抗原剂量-反应物曲钱由计算机处理，计算出抗原浓度。 163、方法评价：敏感度高于单扩510倍，简便快速，结果准确，利用自动化生化分析仪检测，常用于生化指标4、不足之处： 抗体用量大，形成复合物分子的大小和数量足够，耗时较长17（二）免疫散射比浊法基本原理：抗原抗体复合物对一定波长的光产生散射，散射光的强度和抗原抗体复合物的量成正比，也待测抗原量成正比。基本原理：免疫沉淀反应和散射比浊分析结合之技

7、术，反应分两个阶段，预反应阶段和反应阶段1、定时散射比浊分析182、速率散射比浊法原理：连续检测抗原抗体结合反应在每一单位时间内的复合物的形成量，从而找出最大反应速率，即峰值，峰值的高低与抗原的含量成正比。因此峰值经数据处理即可得到抗原的浓度。19散射比浊法方法评价 散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵, 对抗体的质量要求很高。20（三）免疫胶乳比浊法原理：用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2 m），在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳

8、颗粒凝聚 ，使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示：a为单个胶乳颗粒不阻碍光线透过，b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒使透射光减弱或散射光增强。 21免疫胶乳比浊法方法评价优点：本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/L水平，操作简便，易自动化；干扰：血清中的类风湿因子(RF)可与IgG Fc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab)2片段代替IgG既可消除此干扰，又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象； 注意：免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。22四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用（一）免疫比浊测定的影响因素1.抗原抗体比例（海德堡曲线理论） 高剂量钩状效应23（

9、一）免疫比浊测定的影响因素2.抗体的质量 抗体的特异性：抗血清的单价特异性抗体的效价：小于1：20的抗体会增加伪浊度抗体的亲和力：高-加快速度，结合牢固R型和H型： R型亲和力强，等价带宽3、抗原抗体反应的溶液：PH值:6.58.5离子强度：SCN- ClO4 - NO3 - Br - Cl - SO4 - H2PO4 - H2PO4 -24（一）免疫比浊测定的影响因素 4.增浊剂的使用:PEG（34%） 5.伪浊度原因： 标本 抗体 增浊剂 抗血清 比色杯等 离子强度、PH和温度 6.入射光光源和波长（氦氖激光，633，520度） 7.结果报告中的计量单位 8.标准曲线制备与质量控制25（二

10、）临床应用 免疫比浊分析法主要用于检测血浆、体液中的特定蛋白系列，如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、链、链、免疫球蛋白亚类；补体C3、C4；血浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白(2-MG)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、，C-反应蛋白(CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。 26第二节凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验的概念： 可溶性抗原和相应抗体分别放在凝胶内进行扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉

11、淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。最常用的是1%琼脂或琼脂糖凝胶。27 第二节凝胶内沉淀试验凝胶：28一、单向琼脂扩散试验 （平板法）1、原理： 将定量抗体预先混合在琼脂凝胶中，继而加待测的抗原溶液使其单独在凝胶中扩散，在抗原与抗体比例合适的部位，两者结合形成可见的沉淀环，沉淀环大小与抗原的浓度成正相关。通常用已知浓度的标准抗原与待测抗原同时进行试验，根据标准抗原的已知浓度和沉淀环直径对应关系绘制成标准曲线，由待测抗原沉淀环的直径从标准曲线中查出其含量。最常用于补体单一成分及Ig的定量检测。29倾注平板、打孔、加样、放置37、2448h观察2、技术要点抗原抗体+琼脂沉淀

12、环30标准品抗原浓度测定不同病人抗原浓度测定1.测定沉淀环直径或面积2.在标准曲线上查找相应抗原浓度定量方法：31应用： 临床上检测IgG、IgA、IgM、C3、C4等蛋白质样品定量检测。条件：针对某待测抗原的单价特异性抗血清已知浓度的标准品待测标本含量在1.25mg/l以上有。32影响因素：抗体质量（敏感度高的抗血清，且RH）每次测定都同时做标准曲线 ，质控血清扩散时间与温度双环现象：抗原性相同但不同扩散率的两个组分方法评价：稳定简便、重复性和线性均好，灵敏度稍差33二、双向琼脂扩散试验 （平板法）1、原理：将抗原和抗体溶液分别放在凝胶不同的对应孔中，让两者均在凝胶中自由扩散，当抗原与抗体比

13、例合适时形成白色沉淀线或弧。常用梅花形，一般孔距3-5mm，孔径3mm。以出现沉淀线的为阳性。AbAg342、技术要点：制板、打孔、加样、温育12天，出现沉淀线或弧。353、应用 根据沉淀线的形态和位置等可作如下分析：1）抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计2）抗原或抗体相对分子量的分析 3）抗原性质的分析 4）抗体效价的滴定5）抗原或抗体纯度鉴定36AgAbA B C D E F A: 浓度Ag、Ab及分子量近似； B：浓度Ag、Ab近似，分子量AgAb ； C：浓度Ag、Ab近似，分子量AgAb ； D：浓度AgAb，分子量近似； E：浓度AgAb，分子量AgAb ； F：浓度AgAb，

14、分子量AgAb ；检测未知抗原或抗体估计相对浓度和分子量沉淀线靠近谁浓度则小，沉淀弧趋向谁分子量则大372表示标准Ag1表示待检Ag两条沉淀线互相吻合相连，表明两个抗原完全相同。两条沉淀线呈部分相切，表明两个抗原之间有部分相同。两条沉淀线交叉而过，表明两个抗原完全不同。待检Ag与标准Ag性质相同；但含量较低； 抗原性质分析38 1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。 3.抗体可进行任意稀释。 抗体效价滴定39“1” 为单一抗原抗体系统。“n” 为多个抗原抗体系统。*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。抗原抗体纯度鉴定*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。40

15、第三节免疫电泳技术 优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。3.增加了分辨率。电泳分析凝胶内沉淀反应原理immunoelectrophoresis technique 41一、对流免疫电泳原理在PH8.6的缓冲溶液中，将双向扩散琼脂板置于电场中，使带电抗原和抗体在外加电场作用下向相对电极移动，如果两者对应又相遇，在最适比例处形成乳白色沉淀线。抗原和抗体在电场中移动的位置受电泳和电渗两种作用的影响。42一、对流免疫电泳原理：双向免疫扩散+电泳（可定向加速） 比双向免疫扩散试验灵敏度提高816倍，是一种电场内的免疫双扩散。通电蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动抗体球蛋白带负电荷

16、较少，籍电渗作用向负极泳动 counter inmunoelectrophoresis，CIEP 43对流免疫电泳优点及应用电场限制了抗原抗体运动方向，加速了反应速度，使反应时间大大缩短了，灵敏度显著提高了，本法主要用于一些病原微生物及其他蛋白质抗原的检测。44二、火箭免疫电泳 电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。 1、原理单向免疫扩散电泳,定量检测技术rocket immnoelectrophoresis，RI

17、E 451.制备抗体琼脂糖凝胶板2.负极端打孔，加抗原10微升3.电泳：35mA/cm或810V/cm，电泳 6h4.观察沉淀峰，测峰高5、绘制标准曲线图，定量+23mm5mm46沉淀峰高抗原浓度1.测定沉淀峰高度2.在标准曲线上查找 相应抗原浓度绘制标准曲线火箭免疫电泳图为标准抗原；为标本-+471.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状。2.电泳终点时间的确定。3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形.影响因素1.省时、简便、重复性好 。2.灵敏度高（微克/毫升）。方法评价48三、免疫电泳（IEP）原理：区带电泳双向扩散1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带 2、沿电泳方

18、向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散 。 immunoelectrophoresis，IEP 49122、技术要点1）制备琼脂凝胶玻片2）打两孔，加抗原标本和正常对照3） 电泳条件 ：23mA/cm或46V/cm，电泳 1.52h4）挖槽，槽内加混合抗体，双向自由扩散5）观察沉淀线的数目、形状、位置。50纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白（M蛋白）的识别与鉴定影响因素抗原抗体比例不当,需测抗原抗体最适比 抗血清的的抗体谱 ，混合抗血清的使用电泳条件直接影响分辨率应用51-+免疫电泳示意图52四、免疫固定电泳原理：区带电泳沉淀反应 与免疫电泳原理不同之处是将抗血清直接加于电泳后的蛋白质区带表面，抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置形成抗原抗体