菌体浓度对发酵的影响

1、一、菌体浓度对发酵的影响及把握菌体细胞浓度(cellconcentration)是指单位体积培育液中菌体的含量。无论在科学研 究上，还是在工业发酵把握上，它都是一个重要的参数。菌浓的大小，在肯定条件下，不仅 究中，需要利用菌浓参数来算出菌体的比生长速率和产物的比生成速率等有关动力学参数， 以争辩它们之间的相互关系，探明其动力学规律，所以菌浓仍是一个根本参数。 需的时间就越长。典型的细菌、酵母、霉菌和原生动物的倍增时间分别为 45min、90min、3h 和 6h 左右，这说明各类微生物增殖速率的差异。菌体的增长还与养分物质和环境条件有亲热关系。养分物质包括各种碳源和氮源等成分和它们的浓度。依据

2、Monod 方程式来看， 生长速率取决于基质的浓度(Ks 110mgL 之间)，当基质浓度 c(S)10Ks 时，比生长速率就接近最大值。所以养分物质均存在一个上限浓度，在此限度以内(如甲醇、苯酚等)对一些关键 酶的(gL)如下：葡萄糖 100、NH4+5、PO43-10。在实际生产中，常用丰富培育基，促使菌体快速生殖，菌浓增大，引起 (含溶氧)的把握至关重要。影响 菌体生长的环境条件有温度、pH值、渗透压和水分活度等因素。产率与菌浓成正比关系，即P=QPmc(X)式中P发酵产物的产率(产物最大生成速率或生产率)，g(Lh)； QPm产物最大比生成速率，h-1；c(X)菌体浓度，gL。菌浓愈大

3、，产物的产量也愈大，如氨基酸、维生素这类初级代谢产物的发酵就是如此。比 最适菌浓即c(X)临，菌体的生产率最高。但是菌浓过高，则会产生其他的影响，养分物质 各种影响。早期酵母发酵，会消灭代谢途径转变、酵母生长停滞、产生乙醇的现象；抗生素发酵中，也受溶氧限制，使产量降低。如图7-7，为了获得最高的生产率，需要承受摄氧速 率 OUR OTR 相平衡时的菌体浓度，也就是传氧速率随菌浓变化的曲线和摄氧速率随菌浓变化的曲线的交点所对应的菌体浓度，即临界菌体浓度 c(X)临。菌体超过此浓度，抗生素的比生成速率和体积产率都会快速下降。7-7 摄氧速率OUR 曲线与传氧速率OTR 曲线关系示意图 (或过稀)的

4、菌体量。然 长，提高菌浓；但补加过多，则会使菌体过分生长，超过 c(X)临，对产物合成产生抑制作用。在生产上，还可利用菌体代谢产生的CO2 量来把握生产过程的补糖量，以把握菌体的生长和浓度。总之，可依据不同的菌种和产品，承受不同的方法来到达最适的菌浓。基质对发酵影响及其把握的关系。所以选择适当的基质和把握适当的浓度，是提高代谢产物产量的重要方法。Monod c(S)1.1EMP RQ 不同。E.coli 以延胡索酸为基质，RQ=1.44；以丙酮酸为基质，RQ=1.26；以琥珀酸为基质，RQ=1.12；以乳酸、葡萄糖为基 质，RQ 1.021.00。RQ 值也不一样。青霉素发酵的理论呼吸商：菌体

5、生长0.909，菌体维持1，青霉素合成4。从上述状况看，发 酵早期，主要是菌生长，RQ1；过渡期菌体维持其生命活动，产物渐渐形成，基质葡萄糖 的代谢不仅仅用于菌体生长，RQ 比生长期略有增加。产物形成对RQ 的影响较为明显，如产物复原性比基质大，RQ 增加；产物氧化性比基质大，RQ 就削减。其偏离程度打算于每单位菌体利用基质所形成的产物量。实际生产中测定的RQ 物和除葡萄糖以外的其他碳源RQ 值低于葡萄糖为惟一碳源时RQ RQ 为 0.50.7 之间，且随葡萄糖与消泡剂参加量之比而波动。RQ 是碳-能源代谢状况的指示值。在碳-能源限制及供氧充分的状况下，碳-能源趋向于完全氧化，RQ 应到达完全

6、氧化的理论值，见表7-1。假设碳-能源过量及供氧缺乏，可能消灭碳-能源不完全氧化的状况，从而造成RQ 特别。7-1 一些碳-能源基质的理论呼吸商四、CO2 浓度的把握CO2 在发酵液中的浓度变化不像溶氧那样，没有肯定的规律。它的大小受到很多因素 备规模大小也有影响，由于 CO2 的溶解度随压力增加而增大，大发酵罐中的发酵液的静压可达 0.1MPa 以上，又处在正压发酵，致使罐底部压强可达0.15MPa。因此CO2 浓度增大，如不提高搅拌转数，CO2 就不易排出，在罐底形成碳酸，进而影响菌体的呼吸和产物的合成。为了把握CO2 的不良影响，必需考虑CO2 在培育液中的溶解度、温度和通气状况。在发酵

7、过程中，如遇到泡沫上升而引起“逃液”时，承受增加罐压的方法来消泡。但这样会增CO2的溶解度，对菌体生长是不利的。CO2 浓度的把握应随它对发酵的影响而定。假设CO2 对产物合成有抑制作用，则应设液中的溶解氧，还能调整 CO2 的溶解度，在发酵罐中不断通入空气，既可保持溶氧在临界点以上，又可随废气排出所产生的 CO2，使之低于能产生抑制作用的浓度。因而通气搅拌也是把握CO2 CO2 在发酵液中的浓度；反之就会减小CO2 3m3 发酵罐中进展四环素发酵试验，发酵40h 以前，通气75m3h80rminCO2 的浓度；40h 以后，通气量和搅拌110m3h 140rminCO2 2530。CO2 形

8、成的碳酸，还可用碱来中和，但不能用CaCO3。罐压的调整，也影响CO2 的浓度，对菌体代谢和其他参数也产生影响。CO2 的产生与补料工艺把握亲热相关，如在青霉素发酵中，补糖会增加CO2 的浓度和降低培育液的pH 值。由于补加的糖用于菌体生长、菌体维持和青霉素合成三方面，它们都产生CO2，使CO2 量增加。溶解的CO2 和代谢产生的有机酸，又使培育液pH 值下降。因此，补糖、CO2、pH 值三者具有相关性，被用于青霉素补料工艺的把握参数，其中排气中CO2 量的变化比pH 值变化更为敏感，所以，承受测定CRR 作为把握补糖速率参数。第七节补料的把握补料分批发酵(fed-batchculture，简

9、称FBC)，又称半连续培育或半连续发酵，是指在分 连续发酵之间的一种过渡培育方式，是一种把握发酵的好方法，现已广泛用于发酵工业。同传统的分批发酵相比，FBC 具有以下的优点：可以解除底物抑制、产物反响抑制和一例；可作为理论争辩的手段，为自动把握和最优把握供给试验根底。同连续发酵相比， FBC 不需要严格的无菌条件，产生菌也不会产生老化和变异等问题，适用范围也比连续发酵广泛。由于FBC 抗生素类、激素药物类、氨基酸和维生素等十余类几十种工业产品中。一、FBC 的作用FBC 的操作比较简洁，效果也是比较明显的。但是这种把握方法是建立在什么理论根底 结果说明，FBC对微生物发酵有以下几个根本作用。可

10、以把握抑制性底物的浓度在很多发酵过程中，微生物的生长是受到基质浓度的影响。要想得到高密度的生物量， 需要投入几倍的基质。按 monod 方程，当养分底物浓度增加到肯定量时，生长就显示饱和型动力学，再增加底物浓度，就可能产生一种基质抑制区，停滞期延长，菌体比生长速率减 致死(themaldeath)，如乙醇浓度达10时，就可使酵母细胞热致死；有的是因某种或某些 (35)可凝固蛋白；高浓 度基质还会转变菌体的生化代谢而影响生长等。 (或丙酸)分别是青霉素、红霉素的前体物 质，浓度过大，就会产生毒性，使抗生素产量削减。有的是受底物溶解度小的限制，达不到 成转化率不高。质或抑制性底物，承受 FBC 方

11、式，就可以把握适当的基质浓度，解除其抑制作用，又可得到高浓度的产物。可以解除或减弱分解代谢物的阻遏在微生物合成初级或次级代谢产物中，有些合成酶受到快速利用的碳源或氮源的阻遏， 特别是葡萄糖，它能够阻抑多种酶或产物的合成，如纤维素酶、赤霉素、青霉素等。这 制基质葡萄糖的浓度，就可解除酶或其产物的阻遏，提高产物产量。如缓慢流加葡萄糖，纤200 0.02905mgL；承受滴加葡萄糖的技术，可明显提高青霉素的发酵单位等。这都是利用发酵技术解决分解代谢物阻遏的实际应用。在植物细胞培育中，也承受该技术来提高产量。可以使发酵过程最正确化分批发酵动力学的争辩，说明白各个参数之间的相互关系。利用FBC 技术，就

12、可以使菌种保持在最大生产力的状态。随着 FBC 补料方式的不断改进，为发酵过程的优化和反响简单的数学模型在线方式实现最优化把握。二、补料的方式及把握补料方式有很多种状况，有连续流加、不连续流加或多周期流加。每次流加又可分为分补料和多组分补料。流加操作把握系统又分为有反响把握和无反响把握两类不同，又分为直接方法和间接方法。间接方法是以溶氧、pH CO2 分压及代谢产物浓度等作为把握参 需要详尽考察分批发酵的代谢曲线和动力学特性，获得各个参数之间的有意义的相互关系， 来确定把握参数。对于通气发酵，利用排气中CO2 含量作为FBC 反响把握参数是较为常用的间接方法。如把握青霉素生产所用的葡萄糖流加的

13、质量平衡法，就是利用CO2 CO2 的释放率CRR 菌浓。pH 值也已用作糖的流加把握的参数。 些问题(如耐热性差)，尚待解决。随着一系列技术障碍的抑制，该法将会得到快速普及。反响把握的 FBC，经常是依据个别指标来进展，在很多状况下，并不能奏效，尚需进展多因子分析。为了改善发酵培育基的养分条件和去除局部发酵产物，FBC 还可承受“放料和补料” (withdrawandfill)方法，也就是说，发酵肯定时间，产生了代谢产物后，定时放出一局部发 酵液(可供提炼)，同时补充一局部颖养分液，并重复进展。这样就可以维持肯定的菌体生高产量的FBC 方法，但要留意染菌等问题。第八节泡沫对发酵的影响及其把握

14、一、泡沫的形成及其对发酵的影响在大多数微生物发酵过程中，由于培育基中有蛋白类外表活性剂具有较高的外表张 力 面上的泡沫，气相所占的比例特别大，与液体有较明显的界限，如发酵前期的泡沫；另一种是发酵液中的泡沫，又称流态泡沫(fluidfoam)，分散在发酵液中，比较稳定，与液体之间无 明显的界限。 方面，与培育基性质有关。蛋白质原料如蛋白胨、玉米浆、黄豆粉、酵母粉等是主要的发泡 条件等因素有关，其中基质中的有机氮源(如黄豆饼粉等)是起泡的主要因素。当发酵感染杂 菌和噬菌体时，泡沫特别多。 沫乃是保证正常发酵的根本条件。二、泡沫的消退(如少加或缓加易起泡的原材料)或转变某些物理化学参数(如 pH 值

15、、温度、通气和搅拌)或者转变发酵工艺(如承受分次投料)来把握，以削减泡沫形成的时机。但这些方法的效果有肯定的限度；承受机械消泡 泡。机械消泡果不抱负，仅可作为消泡的关心方法。消泡剂消泡用，到达裂开泡沫的目的。如聚氧乙烯氧丙烯甘油(GPE)的外表张力仅为 3.310-2Nm，而青霉素发酵液的外表张力为(6.06.8)10-2Nm。作为生物工业抱负的消泡剂，应具备以下条件：应当在气-液界面上具有足够大的铺 害；来源便利，本钱低；应当对氧传递不产生影响；能耐高温灭菌。常用的消泡剂主要有自然油脂类，高碳醇、脂肪酸和酯类，聚醚类及硅酮类等4 大类。 力和对产物合成的影响各不一样。例如：土霉素发酵，豆油、

16、玉米油较好，而亚麻油则会产生不良的作用。此类油的质量还会影响消泡效果，碘价(表示油分子构造中含有不饱和键的 多少)或酸价高的油脂，消泡力量差并产生不良的影响。所以，要把握此类油的质量，并要 成过氧化物的时机少，酸价也低，消泡力量强，副作用也小 成过氧化物，对四环素、卡那霉素的合成不利，故要留意此类油的贮存保管。合物。氧化丙烯与甘油聚合而成的，叫聚氧丙烯甘油(简称 GP 型)；氧化丙烯、环氧乙烷与甘油聚合而成的叫做聚氧乙烯氧丙烯甘油(简称 GPE 型)，又称泡敌。它们的分子构造式如下：GP 液中的效果好。其抑泡性能比消泡性能好，适宜用于根底培育基中，以抑制泡沫的产生。如6080 倍。GPE 的亲

17、水性好，在发泡介质中易铺展，消泡力量强，作用又快，而溶解度相应也大，所以消泡活性维持时间短，因此，用于黏稠发酵液的效果比用于淡薄的好。GPE 用于四环类0.030.035，消泡力量一般相当于豆油的 10 20 倍。 的消泡作用。消泡剂多数是溶解度小、分散性不格外好的高(大)分子化合物，所以在使用时，要考虑 体增效，即用惰性载体(如矿物油、植物油等)使消泡剂溶解分散，到达增效的目的；消泡剂并用增效，取各种消泡剂的优点进展互补，到达增效，如GP 和GPE l:1 混合使用于土霉素发酵，结果比单独使用GP 2 倍；乳化消泡剂增效，用乳化剂(或分散剂) 80 制成的乳剂，用于庆大霉素发酵，效力提高12

18、 倍。择和实际使用还有很多问题，应结合生产实际加以留意和解决。第九节发酵终点的推断或称生产率、产率是指单位时间内单位罐体积发酵液的产物积存量而言。式中，生产率单位一般为g(Lh)kg(m3h)gL kgm3，发酵时间单位为h。生产过程不能只单纯追求高生产率，而不顾及产品的本钱，必需把二者结合起来，既要有高产量，又要降低本钱。期，养分耗尽，菌体年轻而进入自溶，释放出体内的分解酶会破坏已形成的产物。要确定一个合理的放罐时间，需要考虑以下几个因素： 一、经济因素发酵时间需要考虑经济因素，也就是，要以最低的成原来获得最大生产率的时间为最 (或停顿) 而动力消耗、治理费用支出、设备消耗等费用仍在增加，因

19、而产物本钱增加。所以，需要从经济学观点确定一个合理时间。二、产品质量因素发酵时间长短对后续工艺和产品质量有很大的影响。假设发酵时间太短，势必有过多 的尚未代谢的养分物质() 发酵周期长短对提取工序的影响。三、特别因素在个别特别发酵状况下，还要考虑个别因素。对老品种的发酵来说，放罐时间都已把握，在正常状况下，可依据作业打算，按时放罐。但在特别状况下，如染菌、代谢特别(糖 耗缓慢等)，就应依据不同状况，进展适当处理。为了能够得到尽量多的产物，应当准时采 取措施(如转变温度或补充养分等)，并适当提前或拖后放罐时间。合理的放罐时间是由试验来确定的罐的生产率和产品本钱，承受生产率高而本钱又低的时间，作为

20、放罐时间。 般对发酵和原材料本钱占整个生产本钱主要局部的发酵产品(kg 产物kg 基质)和发酵系数kg 产物(罐容m3h) 时，还应考虑总生产率(放罐时产物浓度除以总发酵生产时间)。这里总发酵生产时间包括发 每吨冷却水所得到的产物产量下跌。另外，放罐时间对下游工序有很大影响。放罐过早，会残留过多的养分(如糖、脂肪、 可溶性蛋白)对提取不利( 会延长过滤时间，还会使产物产量降低(有些抗生素单位下跌)，扰乱提取作业打算。放罐临 近时，加糖、补料或消泡剂都要慎重，因残留物对提取有影响。补料可依据糖耗速率计算到 态、pH 值、培育液的外观、黏度等确定。染菌罐一般过滤速度较慢。放罐时间可依据作业打算进展

21、，但在特别发酵时，就应当机立断，以免倒罐。品种发酵，更需摸索合理的放罐时因素统筹考虑。第十节发酵过程检测与自控发酵过程的根本任务是要对菌株所具有的内在生产力量实现高效表达，从而以较低的 业中的应用目前仍受到很大的局限，需要各学科的专家共同作出进一步的努力。发酵过程检测是为了取得所给定发酵过程及其菌株的生理生化特征数据打算种子罐移种和发酵罐放罐的时间；对不行测变量进展间接估量；对过程变量按给定值进展手动把握或自动把握；通过过程模型实施计算机把握；收集生疏和进展过程(包括建立数学模型)所必需的数据。检测的方法有物理测量(如温度、压力、体积、流量等)，物理化学测量(pH 值、溶O2、溶 CO2、氧化

22、复原电位、气相成分等)，化学测量(基质、前体、产物等的浓度)，以及生物学和生物化学测量()。这些测量可供给反映环境变 7-2中。7-2 发酵过程变量检测系统一、发酵过程对传感器的特别要求为了适应自控的需要，发酵过程变量变化的信息，应尽可能通过安装在发酵罐内的传算机处理。 求，诸如：牢靠性、准确性、准确度、响应时间、区分力量、灵敏度、测量范围、特异性、 感器来说都没有问题，但有的如pH 值和溶氧传感器在灭菌后需要重校准。不能耐受蒸汽灭菌的传感器可在罐外用其他方法灭菌后无菌装入O”形环密封、套管隔断等。还 有如聚 四氟乙烯或抛光的不锈钢，与发酵液的接触面不存在简洁包藏污垢的死角，便于清洗的形状和构造等来抑制。二、发酵过程的主要在线传感器在线传感器的缺乏，始终是制约发酵过程自控的主要因素。经过各学科学者的共同努力，近十多年来在这方面已有很大的进展。现选择一些常见的传感器作一简介。