实验细胞-神经细胞课件

1、神经细胞培养 在神经生理、生化和神经药理的研究中、神经细胞的体外培养日益受到重视，因为它是研究单个神经细胞功能和结构的适宜方法。在体外培养条件下背根神经节、颈上交感节、胚胎脊髓和不同脑区 (海马、下丘脑、大脑皮层、小脑和垂体细胞等)培养细胞的形态特征都不尽相同，这与它们具有不同功能有关。交感和感觉神经元以及不同脑区神经元的体外培养成功, 为我们深入研究它们的结构和功能提供了合适的体外实验模型。一、神经细胞培养主要优点: 1. 分散培养的神经细胞在体外生长成熟后，能保持结构和功能上的某些特点，而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系，这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。 2. 能在较长时间内直接

2、观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化，便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。 3. 易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件，观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。 4. 便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。原代神经细胞培养的类型： 1鸡胚背根神经节组织块培养；2新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养；3新生小鼠颈上交感神经元分散细胞培养；4胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运

3、动神经元培养；5新生大鼠海马神经元分散培养； 6新生大鼠隔神经元分散培养； 7新生大鼠下丘脑神经元分散培养；8新生大鼠大脑皮层神经元分散培养；9新生大鼠纹状体神经元培养；10新生大鼠中脑黑质神经元培养；11新生大鼠小脑神经神经元培养；12新生大鼠脑腺垂体细胞培养；13神经胶质细胞培养；14成年大鼠背根节神经元分散培养；15海马脑片培养；16新生大鼠海马神经干细胞培养。（一）神经胶质细胞培养 1雪旺细胞： 雪旺细胞是外周神经系统最主要的胶质细胞，也是外周神经的成髓鞘细胞；它形成髓鞘，或包裹轴突而不形成髓鞘。雪旺细胞的功能极其活跃，一旦神经受损，它能分裂增殖，分泌神经营养因子，产生细胞外基质和细胞

4、粘附分子，对神经元及其轴突起营养和修复作用。近年来的研究表明，雪旺细胞也能促进中枢神经对脱髓鞘损伤的修复，如对脊髓的再生，对视网膜神经节以及对隔-海马通路再生等。说明雪旺细胞能改善中枢神经再生的微环境，因而近年来对雪旺细胞的研究，尤其是体外培养研究已成热点。材料和方法 雪旺细胞培养材料：各类哺乳动物的外周神经和背根神经节，孵化8-12d鸡胚、出生1-3d 的小鼠或大鼠和人工流产的人胎儿。 无菌用解剖镊分离出神经节，剥除神经节被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37 30min)后用培养液（90%DMEM，10%胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育3

5、0min后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中, 种植密度为0.2105 个细胞/ml，每皿2ml细胞悬液。 36、10%CO2培养箱中培养。接种第3 d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2-脱氧尿苷15g/ml和尿苷35g/ml，以进一步去除成纤维细胞, 作用48小时后更换新鲜培养液，以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。雪旺细胞的生长和形态特征 培养15d后可获得较高纯度的雪旺细胞，雪旺细胞呈双极梭状，核卵居中，相互平行排列，经S-100免疫组织化学染色呈阳性反应。增殖分裂的雪旺细胞可用于进一步传代培养，也可进行冷冻保

6、存备用。 星形胶质细胞具有多种功能： 充填空隙，起结构的支持作用 突起构成血脑屏障 摄取和代谢某些神经递质如-氨基丁酸等 调节局部神经递质的浓度，使神经网络能平稳地发挥作用，调节K+的水平而影响神经元的电生理活动； 能合成和分泌大量神经营养因子，有维持神经元生存和促进神经元突起生长的作用，亦能分泌IL、TNF、和干扰素等多种细胞因子； 有分裂能力，在中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞增生、肥大，填补缺损，形成胶质瘢痕。 纯度鉴定可用胶质纤维酸性蛋白抗体 （GFAP）染色确定。成年大鼠背根节神经元的生长分化和形态特征 成年大鼠背根节神经元在含 NGF 的培养液中种植后4h, 细胞即开始贴附在胶元薄

7、膜层上生长，背根节神经元的胞体一般为圆形，有时亦可见椭圆或梭形，体积较大, 直径约8-14m左右，胞体周围呈现一圈光晕，神经元的细胞核大多偏于胞体一侧，核仁明显。接种后24h，部分贴壁存活神经元开始长出突起。培养2-3天后，神经元突起逐渐增多并延长, 形成稀疏的网络。随着培养时间的延长，神经突起网络变得更加稠密。神经细胞的主干和分枝明显延长并增粗，神经元的胞体逐渐增大。成年大鼠背根节神经元可维持培养2周。（三）海马脑片培养 材料和方法 出生4-7d的Wistar大鼠 无菌取脑、分离出双侧海马，用双面刀片垂直于海马长轴将其切成厚约400m左右的脑薄片，接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中，每

8、皿按切片顺序按Z字形接种10个脑片, 置脑片于36湿盒内孵育2h，使脑片较牢固地贴附在胶原上，然后加入1.5ml饲养培养液，在36、含10%CO2的培养箱内培养。 接种第5 d，在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5 -氟- 2-脱氧尿苷15g/ml和尿苷35g/ml或加入阿糖胞苷 3g/ml以抑制非神经细胞的过度增殖, 作用48h 后更换新鲜培养液，以后每周换液2次，每次更换50%新鲜培养液。海马脑片培养神经元的生长分化和形态特征 海马脑片种植后 24h，可见少数神经元和神经胶质细胞开绐从海马脑片的不同区域向外纤移生长，随着培养时间的延长，可见不同脑区越来越多的神经元和神经胶质细胞向外纤移生长，

9、并形成密集的网络。当加入细胞分裂抑制剂抑制胶质细胞增殖后，可以获得较纯的不同脑区的培养神经元。（四）新生大鼠海马神经干细胞培养 干细胞是指在一定时期具有自我更新能力和广泛发育潜能的细胞，神经干细胞的发现是近年来神经科学领域研究的重大突破，神经干细胞的研究成了近期研究的热点，不仅因为其具有研究神经系统发育的重要性，更主要的是其潜在的治疗价值；神经干细胞研究的主要难点是不能在体内将它们与其它细胞分开，故通常采用在体外培养一段时间后形成细胞克隆，分离出神经干细胞。体外培养可增殖，获得大量神经干细胞，这些细胞若能被诱导分化为某种特异神经元，用以代替损伤神经元，这将为神经再生和功能重建提供充足而理想的移

10、植材料。新生大鼠海马神经干细胞的生长和形态特征 新生大鼠海马细胞在上述无血清培养基中培养 2d后，大部细胞死亡，部分细胞分裂形成，2-4个细胞的细胞团，随着培养时间的延长，细胞团逐渐增大，细胞团数目逐渐多。可用于进一步传代培养也可进行冷冻保存备用。 纯度鉴定可用Nestin染色确定。 NSEGFAP海马神经元原代培养10天 免疫组化鉴定材料与方法： 取当天出生的Wistar大鼠，在无菌条件下分离出双侧海马。用0.125%胰蛋白酶消化(36、30min)分散后，用种植培养液(79% DMEM/F12，10%马血清，10% 胎牛血清，1%谷氨酰胺)，稀释成5106个细胞/ml密度的细胞液， 接种于

11、涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中，每皿2ml，置标本于36、含10%CO2的培养箱内培养。24h后顷去培养皿内种植培养液，改用无血清饲养培养液(98% DMEM/F12， 1% 神经营养素，1% 谷氨酰胺)培养。接种第10 d，在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟- 2-脱氧尿苷15g/ml和尿苷35g/ml或加入阿糖胞苷 3g/ml以抑制非神经细胞的增殖，作用48h 后更换新鲜培养液，以后每周换液2次，每次更换50%新鲜无血清培养液。 2新生大鼠海马神经元无血清培养时 的生长分化和形态特征 新生大鼠海马神经元种植后12h，大部分细胞可贴壁，呈圆形，其中少数神经细胞开始伸出1-2个突起。培

12、养24h后，伸出突起的神经细胞逐渐增多, 突起一般为20-40m，长者可达60m。改用无血清饲养培养液培养3d后, 神经元突起进一步增多并延长，形成稀疏的网络。培养的海马细胞以锥体细胞为多见，胞体较大，直径6-12m。随着培养时间的延长，神经元胞体逐渐增大，胞突主干和分技明显延长并增粗，形成更加稠密的网络。海马神经元在体外可维持无血清培养 1个月。1 NGF是必不可少的营养因子 在背根节神经细胞培养过程中，早期感觉神经元发育阶段，NGF是必不可少的营养因子，但在培养后期，神经元已发育成熟，可能非神经细胞分泌的极少量NGF即能满足神经元生长需要，因此不另加NGF也能维持长期培养。 在上颈交感节细

13、胞分散培养过程中，若最初1-2d在培养液中缺乏 NGF，交感神经元突起不见生长，且大多死亡。培养15d或1个月时，如果培养液中未加入NGF，本来生长良好的神经元很快便出现颗粒变性或空泡， 逐渐死亡。表明NGF对于促进神经突起生长和维持神经元生存有显著作用。 2 细胞接种密度 在神经细胞培养过程中，神经细胞的生长发育受到多种因素的影响，其中细胞接种密度对细胞生长发育影响较大，一般神经细胞的接种密度以0.5-1106 个细胞/ml密度为宜，如每毫升中超过3106个细胞/ml密度，将使细胞簇过大，而且培养皿内过分拥挤， 影响存活和生长。但如果培养的细胞数目过少时，神经细胞的生长分化较差，因为神经细胞

14、是一种细胞群体, 它们相互之间具有营养和支持作用。其次是控制非神经元细胞过多增殖。 3 抗DNA 药物加入培养液 抑制胶质细胞过渡增殖 原代分散单层培养是神经细胞与非神经细胞的混合培养。其中胶质细胞等可在体外继续增殖，神经元则不能增殖而只能生长分化。适量胶质细胞的存在是神经细胞长期培养的必要条件， 如果神经胶质细胞过渡增殖时，神经细胞的生长分化便受到一定影响，常使神经细胞提早开始退化。4 培养液必须保持一定的等渗性 所配制的培养液必须保持一定的等渗性，溶解于培养基的物质浓度所产生的等渗性必须与细胞外液的液体一致，培养神经细胞可将培养液的渗透压调节到320-330 mOso 较为合适。如果培养液是高渗的，细胞会失去水份并发生皱缩，如果培养液是低渗的，细胞会吸收水分而膨胀。两者不利