生自由探索计划项目申书

1、一、基本情况二、课题论证小鼠视神经损伤后Nogo-A 新申报元男1994-一、基本情况二、课题论证小鼠视神经损伤后Nogo-A 新申报元男1994-女1994-男1994-月女1994-芳本项目着重探讨在视神经受到机械损伤后，Nogo-A 蛋白的表达变化。通过测定Nogo-ANogo-A的神经胶质细胞数量的变化以及光镜下的病理变化，提供用于研究 Nogo-A 抑制机制的数据，并了解 Nogo-A 的抑制机制；同时锻炼实验设计操作能力，为往后的科研打下基础。 体中一旦中枢神经系统出现病变无法修复，便会出现运动及感觉 等病症。这都会对 健康及人的正常生活造成影响。而正是因为 CNS 体中一旦中枢神

2、经系统出现病变无法修复，便会出现运动及感觉 等病症。这都会对 健康及人的正常生活造成影响。而正是因为 CNS 无法自身修复的特性，CNS 的再生修复一直是临床医学的研究重点。CNS 修复 ，必须要了解 CNS 不能和 内其他细胞一 能力；CNS中神经元生存微环境中内外源促生长因子和抑制因子对它有影响； 象，但随后没有任何发展。近年来通过进一步的实验发现一些成 中枢神经再生恢复 ，抑制分子将是一个非常好的切入点。2000 年， 、 和英国的三个科研小组同时发现了一种能抑制 CNS受损后再生的 ，命名为 Nogo 。而这种 编码的蛋白质由于不同的启动子和mRNA 的不同拼接有三个版本，分别为Nog

3、o-A，Nogo-B，Nogo-C。Nogo-A 是现在的研究重点。NgR Nogo-A 分子中活性部位Nogo-66 的特异性受体，也为CNS 的再生开拓了新的研究方向。与NgR 结合后抑制信号，通过NgR，p75NTR和LINGO-1（中枢神经系统特异的跨膜蛋白）组成的复合受体传入细胞内，激活 Ras的Rho-A，通过 Rho-A/Rho 激酶作用引起肌动蛋白解聚，导致生长锥塌陷，使轴突再生被抑制Nogo-A 的含量变化，再通过已有的知识在Nogo-A 作用机制的途径中逐步试验最后得到解决CNS 无法自身再生的办法。同时还有实验表明Nogo-66 对早期胚胎神经元生长并无影响，NEP140

4、（NgR N 端140a段）能够竞争Nogo-66与 NgR 结合诱导的生长锥坍塌，还有在体外环境下 NgREcto 可以大大降低 Nogo-66 与表达有NgR 的cos-7 细胞的结合。这些都可以作为寻找使CNS 修复的突破点，可以加以利用。此外研究表明 Nogo-A 也可能是一种促进因子，它Nogo-A 已有的知识了解之上，通过破坏试验Nogo-A 变化值，再在作用步骤中进行探索，得到解决 CNS 修复的办法或者一些新的启示。研究与实践表明， 多数组织具有在损伤后再生修复自身的能力，但成种病症包括肢体运动及感觉 CNS 的再生修复在理论研究表明，CNS（1）CNS神经元缺Nogo-A 在

5、成年和不同发育阶段的神经元中有表达。子 Nogo-A，Nogo-A 在成年和不同发育阶段的神经元中有表达。子 Nogo-A，髓鞘碱性蛋白 MAG，少突胶质细胞髓磷脂蛋白 OMgp，轴突导向因子NetrinsNogo-A因其对CNS损伤后的轴突再生具有 抑制作用关于NogoNogo早期研究中Schwab 等的研究小组证实脊髓白质可产生生长抑制成分。1此研究组从少突胶质细胞中成功分离出抑制蛋白分子量为220 /250 KD的神经生长抑制因子（Neurites growth inhibitor，NI并1针对NI-220 /250的特异性抗体IN-1能和这些抑制性蛋白结合。将IN-122000 年,

6、Chen、Gramdpre 和Prinjha 所在的三个NogoNogo 通过可变启动子和RNA 剪接方式转录的mRNA 有三种，对应三种蛋白。Nogo 具有 C 端网状蛋白同源结构 RHD（Reticulons ）Reticulon（RTNs） 。 RTNs C 端含有一双赖氨酸的内质网膜定位序列（KDEL，Lys-Asp-Glu-LeuNogo 的分部与功能与内质网密切相关。Nogo-A 在这一序列中有两个跨膜区，二者之间有一段 66 个氨基酸长度的亲水结构域，表达于少突胶质细胞表面及其内质网膜中， 制轴突再生的结构域即其长氨基端（Amino-Nogo-A。Nogo-A CNS髓鞘磷脂神经

7、元轴突生长抑制因子，体内体外均 对轴突再生的强烈抑制作用。而NgR也被确认为Nogo-66的受体。2001年，Fournier等运用碱性磷酸酶融合技术发现了Nogo-66（NgR7NgR是Nogo-AMAGOMgp Nogo-A有两个抑制轴突生长的结构域：Nogo-66及其氨基端。Nogo-66与再生中的轴突表面特异性受体NgR 结合后发挥再生抑制作用。Fournier 等7早期的研究发现了NgR 是一种具有多个富含亮氨酸（Leucine-rich-repeats, LLR）的重复结构，并且通过糖脂酰肌醇(glycophosphatidylinositol,GPI)锚定蛋白定位于神经元表面。N

8、gR 与内源性抑制因子 、 gp，特别Nogo-66 结合，通Nogo 受体复合物（p75NTR/NgR1/LINGO-1 TROY/NgR1/LINGO-1）激活下游Rho-A/Rho激酶（ROCK）Calcium 信号途径，进而扰乱肌动蛋白骨架介导生长锥 ，抑制轴突生长，发挥调控神经元可塑性等方面的作用8， 2000 年，Schwab 和 Strittermatter胞，Nogo-A 还表达于大脑、脊髓和外周神经节的某些神经元中4，5。2003年Schwab的研究进一步证明Nogo-A有表达于发育中的神经元。10Nogo 在视神经Nogo 在视神经损伤方视神经概述（属于中枢神经Schwan

9、n 细胞 ，但有髓鞘存在。因此，视神经不是周围神经，而是中枢神经的一个向胶质细胞在损伤条件也发挥与其他部位胶质细胞类似的作用13。其损伤与再Nogo-A在视神经再生 研究证明，可通过 删除、抑制可溶性 NgR Rho-A/Rho 激酶信号通道、提高钙离子浓度、抑制Nogo-66等方法消除Nogo CNS 细胞的轴突 Nogo-A mRNA,3dNogo-AmRNA高表达现象。15，16，17还有学者通过视神经横断大Nogo-A mRNA 14d 后出现高于 7d 的表达7d时出现表达减弱现象。Nogo-A NgR 的表达则与Nogo-A mRNA 的表达不同步。18 国外学者对这方面的研究结果

10、也显示Nogo-A mRNA 的免疫阳性反应出现在视神经损伤部位的周边但是 期呈现低表达。19 此方向的研究而为接下来的科学理论研究提 准的数据与结果，并且临床治疗提供新方向SavioT,Schwab ME. RatCNS whitematter, butnot graymatter,is nonpermissive for neuronal cell adhe and fiber outgrowth J. J Neurosci, 1989, 9(4): BareyreFMHaudenschildBSchwab MEet alLong-lastingsprouting and gene exp

11、res changesinduced by themonoclonalantibody IN-1 headultspinal cordJJ Neurosci，2002，22:7097-, 等. 中枢神经系统轴突再生抑制蛋白J. 生理科学进2004，35（4：31Chen MS, Huber AB, van der Haar ME, et al. Nogo-A is a myelin- asso ted neurite outgrowth inhibitor and an antigen formonoclonal antibody IN- 1. Nature, 2000, 403: 434-4

12、39.GrandPre T, Na uraF, Vartanian T, etal.GrandPre T, Na uraF, Vartanian T, etal.Identification oftheNogoinhibitorof axon regeneration as a Reticulon protein. Nature, 2000, 403: 439-444.Prinjha R, Moore SE, VinsonM, et al. Inhibitor of neurite outgrowth in humans. Nature, 2000, 403: 383-384.Fournier

13、 AE, GrandPre T, Strittmatter SM. Identificat ion of a receptor mediating Nogo-66 inhibit ionofaxonalregeneration J. Nature, 2001, 409(6818):341-346.Schwab ME. FunctionsofNogoproteinsand theirreceptors henervoussystem J. Nat Rev Neurosci, 2010 ,1(12):799-811repaiJNeurosci，2003，26: 411 440Meier S, Br

14、auer AU, Heimrich B et al. Molecular ysis of Nogo in the hippoc us during development and following le and seizure. FASEB J. 2003, 17(9):1153-1155.Josephson A, Widenfalk J, Widmer HW et al. NOGO mRNA expres in adult and fetal human and rat nervous ti e and in weight drop injury. Exp Neurol 2001, 169

15、(2):319-328.Xiong K, Cai HB, Luo XG, et al. Mitochondrial respiratory inhibition and oxidative stre evate beta-secretase (BACE1) proteins and activity in vivo he rat retina. Exp. Brain Res., 2007, 181 (3): 435-446.Nickells RW. From ocular hyperten to ganglion cell death: a theoretical sequence of ev

16、ents leading toa. Can J Oph lmol. 2007, 42 (2): 278-287.Nogo 在视神经损伤后再生中的研究进展国际眼科杂志 2013，13( 9) : 17821784， ， ，等. 视神经损伤后Nogo-A mRNA 表达的变化J. 中华眼底病杂志. 2003，19(4) : 247-249Nogo 受体在视神经及视网膜的表达变化 潍坊医学院学报. 2008， 30( 4) : 332-334蔺海燕, 许家军, . 大鼠视神经吸断后相关分子表达的变化. 解剖学杂志. 2006，29: 30- 34. 视神经横断后生长抑制因子 Nogo mNA 表达的

17、变化及意义. 医学杂志，2008，19(5) :326329对Nogo-A19David对Nogo-A19David t,R.S.Coffin,R.K.Prinjha,etal.MolecularandCellular Neuroscience 24 (2003) 10831102Nogo-A在受伤组织部位的浓度以及探讨其与损伤参与表达Nogo-A的少突胶质细胞的数量以及探讨其与损伤天数的关系；Wistar大鼠60只，将其随机分为A（10只、B（25只、C（25 只）60 只；A 组为空白对照组，B 组为半实验组，C 组B组的小鼠的右眼眼神经，左眼只 眼神经C 组小鼠的双眼的眼神经；A 组小鼠

18、只 眼神经。具体操作方法如下对小鼠视神经采用夹伤，常规腹腔内注射 0.15%戊巴比妥钠，注射标准为 1mL/kg。在手术显微镜(OMS-110,Topcon)下进行手术操作,在上眼睑缘 做垂直切口向上延伸 1cm 后,再做横行切口,长约 1cm,整个切口呈“T”形。剪开穹窿部结膜,沿上直肌方向分离,寻找视神经。剪开视神经 ,40g 视神经损伤夹 (OX60,德国)在球后 2mm 处垂直于视神经水平轴造成视神经损伤,夹持时间为 取出大鼠眼球,分离视神经，自 插管入升主动脉，剪开右心耳，自插4%多聚 200mL进行内固定。自大鼠颅骨后缘用止血钳咬开骨壁，逐步向前推进，注意不要损伤脑组织，充分 眶壁。剪开角膜缘结膜,向后分离至视神经,咬除上方和两侧眶骨, 分离视神经,在视神经进颅处为视神经的最细处,周围为骨所包围,要 咬除其周围骨壁。用显微无齿镊轻轻将其托出,在多聚 中过夜。 ,做HE染色于光镜下观察不同损伤测定Nogo-A测定表达Nogo-A对表达Nogo-A对表达Nogo-A,