细胞免疫荧光实验步骤

1、细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤简单实验步骤如下：漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度PBS 2小时.-20度甲醇固定20分钟后，自然、干燥10分钟PBS 洗净：3min*34.1%Triton:25min-30min.配成 50ultriton+5mlpBSPBS 洗净：2*5min羊血清封闭：37度，20分钟一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者3 7度 1 2小时8.4 度 PBS 洗净，3min*5 次9.二抗 37度小于一小时10.37 度 PBS 洗净，3*5min凉十封片（封闭液PH8. 5）活细胞免疫荧光技术一流式细胞仪标本的制备（一）制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、

2、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）!用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为5X1061X107/ml!取40ul细胞悬液加入预先有特异性McAb（550U1） 的小玻璃管或塑料离心管，再加50ul 1：20（用DPBS 稀释）灭活正常兔血清|4C 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpmX5min!弃上清，加入50U1工作浓度的羊抗鼠（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇!4C 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpmX5min!加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100

3、500 U1固定液）!FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存57天）（二）试剂和器材各种特异性单克隆抗体。荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液（见附录）。玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。（三）注意事项整个操作在4C下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN 3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假 阴性。加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防 止非特异性染色。细胞活性要好，否则易发生非特异

4、性荧光染色。附：DPBS （X10,贮存液）NaCl 80gKCl 2g蒸馏水加至1000mlNa2HPO4 11.5g临用时用蒸馏水1 ：10稀释KH2PO4 2g洗涤液DPBS900mlFCS 50ml （终浓度 5%）4%NaN3 50ml （终浓度 0.2%）固定液DPBS1000ml葡萄糖20g （终浓度2%）甲醛10mlNaN3 0.2g （终浓度 0.02%）玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。（三）注意事项整个操作在4C下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN 3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗

5、相结合，出现假 阴性。加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防 止非特异性染色。细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。附：DPBS （X10,贮存液）NaCl 80gKCl 2g蒸馏水加至1000mlNa 2 HPO 4 11.5g临用时用蒸馏水1 ：10稀释KH2PO4 2g洗涤液DPBS900mlFCS 50ml （终浓度 5%）4%NaN3 50ml （终浓度 0.2%）固定液DPBS1000ml葡萄糖20g （终浓度2%）甲醛10mlNaN3 0.2g （终浓度 0.02%）严重同意楼上的讲解。我是做流式细胞分析的间接荧光，图简单加一抗后只洗涤 一次，二抗后没

6、有洗涤，就直接加另外一个抗体，结果做了好多次就是呈阴性反 应！排除了好久才多洗涤了两次，结果很是令人满意。我想请问楼上：NaN3哪里有卖？谢谢！我找过，发现它是一种化学工业产品， 成桶成桶的卖，而且有剧毒啊！是不是不是同一种东东？我做的是zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。2、用预温的1XPBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1XPBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100 透化 2-5 分钟6、1XPBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗（用1%BSA稀释）放在湿盒里

7、，4度过夜9、1XPBS洗3次，每次10分钟10、加二抗（用1%BSA稀释）30分钟，闭光11、1XPBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA 均用 1 XPBS 稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正 面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候MBS不要太冲，不 要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10 分钟。4%冷

8、的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。0.2%Triton X-100 通透 10 分钟，PBS 洗三遍。与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会 十，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问 题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一 定要避光保存，保存的好

9、的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之 前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光 光点，非常难看。我要做的是occludin，可是效果不是很好，可以用甲醇固定吗，和甲醛比那个 合适各位同仁:我现在急于做人乳腺癌细胞MCF-7的免疫荧光实验，目的是测凋亡时，基因bax、 bcl-2的蛋白表达变化。不知道怎么选一抗和二抗试剂盒。请高手指教。万分感谢!能发一个邮件更好，再一次感谢！我的 E-mail： .cn抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可.之后片子可保留更长时间bu不是原创我是做悬浮细胞THP-1的，是人单核细胞系，主要问题是悬浮细胞在洗涤以及孵 育次

10、数多了会越洗越少，请问各位怎么洗法细胞不会变少。（离心转速比较重要， 还有有人说离心后上清不用移液器吸，直接倒比较好，我也试过，可还是越来越 少）顶一下我也遇到了同样的问题，不知那位高人能够指点迷津？另悬浮培养的细胞是不是 也需要先固定在做后面的处理？我听说悬浮细胞是最后一步才固定，我的实验步骤中太多道听途说啊，没办法， 找不到完全相同的文献，很多protocol都是针对贴壁细胞。不是悬浮细胞，是检测的蛋白在细胞膜上的是最后一步固定MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂 3-（4，5）-dimethylthiahiaz（-z-y1）-3 5-di- phenytetrazoliumromide M

11、TT唾唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的 染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目 成正比死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含 50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的 MTT溶解液中溶解，利用 酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO 来溶解。MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超 净台上的日光

12、灯来避光，觉得这样比较好。一、步骤1、接种细胞用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96 孔板，每孔体积200ul。2、培养细胞同一般培养条件，培养3-5天可根据试验目的和要求决定培养时间)。3、呈色培养3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配)20ul继续孵育4小时，终止培养， 小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO ，振荡10分钟，使结晶物充分融解。4、比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐 标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。二、注

13、意事项1、选择适当得细胞接种浓度。2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽 孔内残余培养液。3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致， 最后比色以空白调零。MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度， 然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50%抑制 率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！三、举例各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、

14、0.00001、0.000001，稀释倍数为 10，最大浓度 为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式:Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025有一个公式可供参考；lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm : 1g最大剂量I尾最大剂量才目临剂量)P :阳性反应率之和Pm :最大阳性反应率Pn :最小阳性反应率抑制率

15、=1-加药组OD值/对照组OD值公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率例：用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少 MTT 和DMSO 合适?根据书上说的加200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加DMSO 之前 要尽量去掉培养液，便于DMSO 溶解甲臜颗粒进行比色测定一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗 掉上清液，注意不要将甲瓒洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然 后测吸光值。一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检

16、测碎片太多。我 一般用1/2-1/的勺IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用 药后一般为5-10%(Annexin V)，细胞周期的亚G0峰比较明显。一、开机程序1、检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。2、打开储液箱，倒掉废液，并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取 出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow)，合上 压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。3、将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY ，预热5-10 分钟。排出过滤器内的气泡。4、如果需要打印

17、，打开打印机电源。5、打开电脑，等待屏幕显示出标准的苹果标志。6、执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow Cell中的气泡。7、分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN 约2分钟。8、做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通 浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。二、预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1、从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文 件。2、选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot绘出一个或多个Dot P

18、lots点图)。从Dot Plot 对话框中选取Acquisition为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。3、选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。4、将此视窗命名后储存于 FACStation G3BD Applications CELLQuest Folder EXP文 件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。5、 本计算机中已设定两个模式文件：ACQ 和EXP，储存于FACStation G3BD Applications CELLQuest EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标 志分析。三、用CELLQue

19、st进行仪器的设定和调整1、从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获 取模式文件。2、从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer快捷键：+B）进行电脑 和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control话框移至合适位置。3、从 Cytometer 指令栏中，开启 Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status 等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1， 2，3，4获得此四个对话框。4、在Detectors/Amps对话框

20、中，先为每个参数选择适当的倍增模式（amplifier mode） 线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时， FSC和SSC多以线性模式Lin测量，且DDM Param 选择FL2，而FL1， FL2与FL3则以 对数模式Log测量分析细胞DNA含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Lin进行测 量，且DDM Param 选择FL2;分析血小板表型时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以Log 进行测量。5、放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN，流速可在HIGH或LOW上。6、在Acquisiton Control话框中，

21、选取Acquire，开始获取细胞。在以下的仪器调整 过程中随时选取Pause，Restart以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUP前 的“ ”。7、 在Detectors/Amps对话框中，调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMT voltages粗调）与Amp Gains（细调），使样品信号出现在FSC-SSC 点图内，且三群细胞合 理分布。8、在Threshold对话框中选择适当的参数设定Threshold，并调整Threshold的高低， 以减少噪音信号（细胞碎片）。一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA时用FL2-H。Threshold 并不影响检测器对信号的获取，但

22、可改善画面质量。9、从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域），并在靶细胞周围设定区域线，即通常所 说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。10、在Detectors/Amps对话框中，调整荧光检测器（FL1， FL2，FL3，FL4等）的倍 增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。11、在Compensation对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色或多色） 荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1+ FL2-的细胞群却分布在FL1+ FL2+区域内，则需调大FL2-?%FL1中的?”，并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当12、在 St

23、atus对话框中可见：Laser Power:正常值一Run/Ready 为 14.7mW，Standby 为 5mW;Laser current:正常值为 6Amps 左右。13、调整好的仪器设定可在Instrument Settings对话框中储存，下次进行相同实验时 可调出使用，届时只需微调即可。四、通过预设的获取模式文件进行样品分析1、 从苹果标志中选择CELLQUEST，新视窗出现后从File指令栏中选择Open，打开 预设的获取模式文件。2、从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer进行电脑和仪器的连机。 将出现的Acquisiton Contrc对话框移至合适位置。3、从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings在其对话框中选择Open以调出 以前存储的相同实验的仪器设定，按Set确定。4、在Acquire指令栏中，选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数，参数，信号道 数。其中Resolution在做细胞表面标志时选择256,做DNA时选择1024 oParameter Saved . 则根据不同的检