miR-205在胆碱能抗炎通路中降低HMGB1表达

1、miR-205 在胆碱能抗炎通路中降低HMGB1表达目的：既往研究发现 ,miRNA在胆碱能抗炎通路中参与早期炎症TNFa和 IL-6的调控 , 而晚期炎症因子是脓毒症持续发生的基础。本研究目的为： (1) 胆碱能抗炎通路作为一种转录后调节, 与 miRNA调节方式相同 , 那么在胆碱能抗炎通路中是否存在调节晚期炎症因子HMGB1的 miRNA,利用 miRNA芯片筛选确定差异 miRNA。从细胞学水平验证筛选的 niRNA能靶向调节 HMGB1。 (3) 通过动物实验 ,在组织学水平判断目的miRNA在体内能发挥胆碱能抗炎通路的作用, 并对各器官中调节作用的差异进行研究。方法： (1) 利用

2、 miRNA芯片筛选 RAW264.7在脓毒症和胆碱能抗炎通路中, 晚期炎症因子表达高峰时miRNA表达的差异 , 利用差异倍数值 (Fold change, Fc)找出在胆碱能抗炎通路中表达升高大于脓毒症组2 倍以上的目的 miRNA,GeneSpring 12.5 软件 , 分别用 PITA, TargetScan, microRNAorg三个数据库对符合要求的差异miRNA进行靶基因预测 , 选出三个数据库筛选出基因的交集, 进行后续的基因本体 (Gene Ontology, GO) 和京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopedia of Genesand Genomes,

3、KEGG)的富集分析研究。 (2) Real-timePCR验证目的 miRNA芯片表达的准确性。利用 miR-205 mimics 和 inhibitor转染 RAW264.7,通过对脓毒症组和胆碱能抗炎通路组 miR-205、HMGB1和 HMGB1mRNA的表达验证 miRNA作用的靶基因。检测脓毒症小鼠和胆碱能抗炎通路小鼠血清、脑、心、肺、肾、肝、脾、大肠组织中 miRNA、HMGB1和 HMGB1 mRNA表达的差异 , 观察 miRNA在组织中的抗炎作用。结果：(1) 本研究优化了 RAW264.7细胞脓毒症 LPS浓度和激活胆碱能抗炎通路的 GTS-21药物剂量 , 分别是 50

4、ng/ml 和 8g/ml 。BALB-c 小鼠的最佳药物剂量LPS为 15mg/kg,GTS-21 为 4mg/kg。(2) 利用差异倍数值 , 在胆碱能抗炎通路中表达升高大于脓毒症组2 倍以上的目的 miRNA共 38 个 , 其中只在胆碱能抗炎通路中升高的miRNA有 4 个, 分别是miR0205、196a、193b、31。对 miRNA进行靶基因预测出2019 个靶基因分布于66 条通路。选取胆碱能抗炎通路组浓度升高倍数较大的 miR-205 进行 qRT-PCR验证 ,与芯片的检测结果一致。通过对RAW264.7转染 miR-205 mimics 和 inhibitor,转染 mi

5、R-205 mimics 的 RAW264.7加入 LPS后 HMGB1表达显著低于脓毒症组； 转染 miR-205 inhibitor组加入 LPS+GTS-21抗炎作用消失 ,HMGB1表达明显升高。两组 HMGB1mRNA表达差异没有显著性。 (4) 在对血清、肺、肝脏、脾脏、大肠、脑、肾、心脏等组织的脓毒症组和胆碱能抗炎通路组miR-205 做 qRT-PCR检测 , 观察两组不同组织中miR-205 的表达变化。检测的 8 个器官的组织表达差异均有显著性。胆碱能抗炎通路组的miR-205比 sepsis 组明显升高。其中 GTS-21组中血清、肝、肠、的组织表达超过 sepsis 组

6、 3 倍以上。而脑、肾组织的 miR-205 在 CAP组表达升高 2 倍左右 , 在心肌组织中升高不足一倍。血清、脑、肾、肠组织 ,p0.0001；肝 p=0.0011, 脾 p=0.0054, 心 p=0.0049肺 p=0.0032。用 ELISA 法对各组织中 HMGB1浓度检测 , 胆碱能抗炎通路组各器官HMGB1较脓毒症组表达下降。血清 p=0.0063, 脑、肾 p0.05)。结论： (1) 通过 miRNA芯片对激活胆碱能抗炎通路时调控晚期炎症因子的miRNA进行首次全基因谱筛选。 发现至少有 4 个 miRNA与晚期炎症因子表达调控有关 , 分别是 miR-205、 miR-193b、miR-196a 和 miR-31。预测出 2019 种靶基因并进行KEGG分析 , 共得到 66 条有意义的通路。 (2) 通过 miR-205 mimics 和 inhibitor 转染 RAW26