蹄叶橐吾乙醇提取物对肝细胞色素P450的影响

1、蹄叶橐吾乙醇提取物对肝细胞色素P450的影响【摘要】目的研究蹄叶橐吾乙醇提取物对大鼠和小鼠肝细胞色素P450YP450的影响。方法蹄叶橐吾乙醇提取物口服给药后，观察其对小鼠戊巴比妥钠催眠作用的影响、对大鼠肝微粒体YP450含量、肝脏指数的影响，采用HPL测定探针药的代谢率观察其对大鼠肝YP450的7种亚型酶活性的影响。结果蹄叶橐吾乙醇提取物对戊巴比妥钠诱导小鼠的睡眠时间无影响，大鼠肝YP450含量及肝脏指数无显著变化，对大鼠肝YP450的7种亚型探针药的代谢率亦无影响。结论蹄叶橐吾乙醇提取物对肝药酶无诱导作用。【关键词】蹄叶橐吾；肝细胞色素P450；诱导作用细胞色素P450ythreP450,

2、YP450是生物体内参与各类外源性及内源性物质代谢的主要酶系，负责90%以上药物的生物转化。YP450的活性可受到多种因素的影响。近年来，由于药物代谢性互相作用诱发的不良反响日渐引起人们的重视。但有关中草药对YP450影响作用的报道尚不多见。蹄叶橐吾Ligulariafisheri为菊科pasitae橐吾属(Ligularia)多年生草本植物，又名肾叶橐吾?中药志?、马蹄叶东北等，其根和根茎收入吉林省药材标准，名山紫菀1。药理研究说明，其根和根茎具有镇咳祛痰作用2，叶的提取物具有抗氧化作用3，4，地上局部乙醇提取物具有抗炎免疫5，6和抗溃疡作用7。且蹄叶橐吾的平安性较高8，9。本实验通过研究蹄

3、叶橐吾地上局部乙醇提取物对肝YP450的影响，预测其在结合用药时可能会产生的代谢性互相作用，对蹄叶橐吾临床合理用药提供科学根据。1材料与仪器1.1药品蹄叶橐吾野生在吉林省珲春市采集，由延边大学药学院刘永镇教授鉴定。蹄叶橐吾地上局部乙醇提取物ethanlextratfrLigulariafisheri，以下简写为Lfe的制备：蹄叶橐吾地上局部晾干、粉碎，用95%乙醇加热回流提取，滤液加水放置24h，过滤后用石油醚萃取，水层加热浓缩至浸膏，每克相当于20g生药，实验用其水溶液灌胃给药。1.2试剂非那西汀phenaetin，双氯酚酸Dilfena，奥美拉唑eprazle，氢溴酸右美沙芬Dextret

4、hrphanHydrbride，氯唑沙宗hlrzxazne，氨苯砜Dapsne,ainphenylsulfne均购于中国药品生物制品检定所,香豆素uarin购于沈阳市试剂三厂化学纯。葡萄糖-6-磷酸D-Gluse6-phsphatedisdiusalthydrate、氧化型辅酶(-Nitinaideadeninedinuletidephsphatesdiusalthydrate,-NADP)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Gluse-6-phsphateDehydrgenase)购于siga公司。戊巴比妥钠，Serva进口分装上海化学试剂分装厂。HPL级甲醇、乙腈购于美国Fisher公司。1.3仪器

5、美国TherFinnigansurveyr高效液相色谱仪配有四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器；Xalibur1.4色谱工作站；AgilentXDB-18色谱柱(4.6250，5)；日本岛津ShiadzuUV-260紫外可见光分光光度计；QX-200酶标仪美国Bi-TekInstruentsIn.；EYELA旋转蒸发仪N-1000SD-2000；BEKAN公司高速冷冻离心机；2K-15型高速离心机(Siga)；YKH-3型液体快速混合器江西医疗器械厂；瑞士ETLERTLED公司AG135型电子天平。2方法2.1Lfe对小鼠戊巴比妥钠催眠作用的影响小鼠随机分为两组，每组10只。药物组灌胃(ig

6、)给予Lfe250gkg-1，对照组ig同体积生理盐水，1次/d，连续3d。末次给药后24h各组小鼠均腹腔注射(ip)戊巴比妥钠50gkg-1。室温2225，ip戊巴比妥钠的时间在上午9时左右。观察小鼠的睡眠时间(从翻正反射消失至恢复的间隔时间)。2.2Lfe对大鼠YP450含量及各亚型酶活性的影响大鼠随机分为2组，每组8只。药物组灌胃给予Lfe250gkg-1，对照组ig同体积生理盐水，1次/d，连续3d。2.2.1大鼠肝微粒体的制备末次给药后24h将大鼠处死，采用差速离心法制备肝微粒体。取肝脏，漂洗、吸干、称重后剪碎，按13(/V)比例参加TS缓冲液含0.05lL-1Tris，3lL-1g

7、l2，0.2lL-1蔗糖，pH7.4匀浆后于4，10000g，离心30in，取上清液转移至超速离心管内，4离心，100000g，60in，沉淀即为肝微粒体。重悬后分装，置-80冰箱内保存备用。微粒体蛋白浓度采用Bradfrd法测定10。2.2.2YP450含量及肝脏指数的测定采用ura和Sat的方法测定YP450含量11。P450(nlg-1蛋白)=A(450n-490n)1000/91蛋白浓度gl-1。计算肝脏指数，肝脏指数g/100g体质量=肝重/体质量100%。转贴于论文联盟.ll.2.2.3肝微粒体体外温孵实验将Lfe给药组8只大鼠的微粒体蛋白稀释至一样浓度后等体积混合，分装至各管。对

8、照组大鼠微粒体亦作一样处理。将探针药香豆素YP2A6底物、右美沙芬YP2D6底物、双氯酚酸YP29底物、奥美拉唑YP219底物、氨苯砜YP3A4底物、非那西汀YP1A2底物、氯唑沙宗YP2E1底物分别与给药组或对照组大鼠的肝微粒体于37温孵。以pH7.4的Tris-Hl缓冲液0.5l为总反响体系，其中肝微粒体蛋白浓度1gl-1，NADPH生成系统(NADP1lL-1,葡萄糖-6-磷酸10lL-1，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1Ul-1)，gl24lL-1。探针药浓度及温孵时间见表1。反响体系中有机溶剂终浓度不超过0.5%V/V。表1各探针药浓度、温孵时间及色谱条件(略)2.2.4肝微粒体温孵样品的处

9、理及HPL测定各反响管温孵一定时间后参加3L甲醇终止反响，涡旋振荡1in，离心，取上清3L，35减压蒸干，残渣用100l流动相复溶，离心10000rin-1，10in，取上清，进样20l。应用HPL测定上述探针药的代谢率，与对照组比拟，以反映Lfe对上述YP450各亚型是否有诱导作用。其中氨苯砜，非那西汀，氯唑沙宗的测定采用“鸡尾酒(ktail法。2.3统计处理实验结果以s表示，采用SPSS13.0统计软件进展方差分析。3结果3.1Lfe对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响与对照组相比，Lfe连续给药3d，戊巴比妥钠诱导小鼠的睡眠时间无显著性差异P0.05，说明Lfe对小鼠肝药酶无诱导作用。结果

10、见表2。表2Lfe对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响(略)3.2Lfe对大鼠肝YP450含量及肝脏指数的影响结果显示，Lfe连续给药3d后，大鼠YP450含量及肝脏指数与对照组相比均无显著性差异(P0.05),说明Lfe对大鼠YP450无诱导作用。结果见表3。表3Lfe对大鼠肝YP450含量及肝脏指数的影响(略)3.3Lfe对大鼠YP450各亚型酶活性的影响3.3.1色谱行为如图1所示，在选定的HPL条件下各探针药峰形较好，肝微粒体内源性物质对其测定无干扰，可作为各探针药定量分析的条件。3.3.2各探针药代谢率的测定结果结果说明，Lfe口服给药3次后YP1A2,29,219,2D6,2E1,3

11、A4,2A6等7种YP450亚型特异性底物的代谢率与对照组相比均无显著性差异，说明Lfe对上述7种YP450亚型酶无诱导作用。结果见图2。与表3结果-Lfe对YP450含量及肝脏指数无明显影响相一致。4讨论药物互相作用最常见的原因是YP450的诱导和抑制。药酶的诱导可增加生物转化率，从而降低药物浓度，使药效减弱，假如代谢形成活性产物那么会增强药物的作用或毒性。在药物代谢性互相作用中，酶诱导引起的互相作用约占23%，因此提醒蹄叶橐吾地上局部乙醇提取物Lfe对肝YP450的影响对于其临床合理用药具有重要意义。为理解Lfe是否存在潜在的代谢性互相作用，本实验观察了Lfe对药物代谢酶YP450的影响。

12、戊巴比妥钠由肝脏代谢，其诱导小鼠睡眠时间的长短可反映肝药酶的活性。以戊巴比妥钠诱导小鼠的睡眠时间作为观测肝药酶体内活性变化的生物学指标，并利用整体动物屡次给予Lfe后肝微粒体YP450含量、肝脏指数、肝YP450酶活性的变化观察其对YP450酶是否有诱导作用。Lfe250gkg-1连续给药3d，对戊巴比妥钠诱导小鼠的睡眠时间无影响，间接提示Lfe对小鼠肝药酶无诱导作用。Lfe250gkg-1连续给药3d后，大鼠肝YP450总量和肝脏指数无显著变化，提示Lfe对大鼠肝药酶无诱导作用。但上述作用是否系Lfe对YP450多种亚型酶诱导和抑制作用的综合结果尚不能确定。因此，我们进一步研究了Lfe对YP

13、450多种亚型酶活性的影响，主要是7种参与临床常用药物代谢的YP450同工酶。研究结果显示，大鼠连续口服Lfe后的肝微粒体对YP1A2，29，219，2D6，2E1，3A4，2A6等7种亚型酶的特异性探针药的代谢率均无影响，说明Lfe对上述7种YP450亚型酶活性均无明显影响。综合上述结果，Lfe对肝药酶无诱导作用。提示在将降临床试用时与同服的其他药物可能不致会因肝药酶的诱导作用而影响有关药物的药效或毒性。关于Lfe对肝YP450是否具有抑制作用尚需进一步实验证实。【参考文献】1吉林省卫生局.吉林省药品标准S，1997:238.2李茁，樊变兰，于庆海，等.山紫菀与紫菀镇咳祛痰作用的实验研究J.

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