木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建

1、木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建【摘要】目的克隆木薯醇腈酶HNLDNA构建表达载体，以实现木薯醇腈酶基因的高效表达。方法运用RT-PR从木薯幼叶组织中扩增出HNL全长DNA序列，将其克隆至质粒pBluesriptSK中进展序列分析，再利用PR将其再克隆到酵母表达质粒pPI3.5K上。结果经测序分析说明，克隆的DNA片段和文献报道的4个木薯HNLDNA相比，核苷酸同源性最高为99.1%，氨基酸同源性最高为98.8%。结论经双酶切鉴定的结果说明重组表达载体的表达载体构建成功。【关键词】木薯；醇腈酶；甲醇酵母；表达载体Abstrat：bjetiveTstudythelningftheDNA

2、f-HNLandtheexpressinvetrnstrutintrealizehighlyeffiientexpressininNLgene.ethdsThelng-lengthsequenefDNAf-HNLasaplifiedbyRT-PR,thenitaslnedintpBluesriptSKandanalylizdinitssequene.Finall,theDNAaslnedintanexpressinvetrpPI3.5KbyPR.ResultsThesequeningresultftheDNAshedthatthesequeneendedfrtheHNLasntfullynsi

3、stentiththsepublished.ThefullsequenesanalysisdenstratedthatthehighesthlgyfDNAsequeneisabut99.1%andthehighesthlgyfainaidsequeneisabut98.8%tthsefurreprtedHNLgenesfrassava.nulsinDegestindetetinfpPI3.5K-HNLshedthatnstrutinfrebinatinexpressinvetrassuessful.Keyrds:avassa；Hydrxynitrilelyase；Pihiapastris；ex

4、pressinvetr手性化合物中不同立体异构体具有不同的生理活性，许多医用药品要求必须是单一性化合物，不仅药效可进步，更为重要的是副作用校因此，研究和开发手性药物具有广泛的市场需求。醇腈酶-Hydrxynitrilelyase,E.4.1.2.10，HNL作为一种生物催化剂，能可逆的催化由HN和醛或酮生成手性氰醇1，2，从而克制了由于光学拆分而造成的本钱较高的缺点。以工业消费扁桃腈为例，传统方法是以苯甲醛为原料，与无水HN反响后得到dl-扁桃腈，再进展光学拆分成为单一化学物，而采用HNL作为该反响的催化剂，直接催化HN添加到醛或酮上，形成相应的具有光学活性的氰醇，从而实现扁桃腈的不对称合成，

5、大大降低了消费本钱，反响生成的光学活性氰醇还可转化成羟基化合物、胺化合物、羧基化合物等多种重要的手性中间体3，后者可进一步转化成多种手性药物。现已证实3000多种植物体内含有HNL。相关研究主要集中在木薯、三叶胶以及蔷薇科的几种植物中4，来自蔷薇科植物的HNL可催化R-型氰醇化合物的合成；木薯、三叶胶中的HNL那么立体专一性催化脂肪族、芳香族和杂环族型羟腈化合物的合成5。从自然界中直接获取型醇腈酶不仅得率低，且纯化较难。因此，采用基因工程技术获得大量HNL以满足工业消费的需求，具有非常重要的经济意义，并有助于HNL的根底研究。通过RT-PR方法从木薯幼叶组织的总RNA中扩增出一种HNL基因的D

6、NA序列。序列分析说明，与DNA数据库公布的已有木薯HNL编码序列不完全一致。将其克隆至表达质粒pPI3.5K中，构建重组表达载体，为下一步在甲醇酵母中实现高效表达，深化研究其作用机理以及开展工业消费奠定了基矗1材料和方法1.1材料1.1.1植物材料木薯采自中国海南琼海，取当天采集的新颖木薯的幼嫩叶子提取RNA。1.1.2菌种和质粒表达质粒pPI3.5K购自Invitrgen公司；大肠杆菌(E.liJ109),质粒BluesriptSK(pBS)由本实验室保存。1.1.3酶和试剂RT-PR试剂盒、RNA提取试剂盒、DNA连接试剂盒购自上海华舜生物工程；抗生素G418购自Sigia公司；限制酶、

7、TaqDNA聚合酶，其它抗生素等分别购自华美生物工程公司、Prega等公司；其他化学试剂均为国产分析纯或进口分析纯。1.1.4培养基LB，LA，SB，S培养基均按Invitrgen公司操作手册推荐方法配制。1.2方法1.2.1基因操作质粒DNA的制备、限制酶切、连接反响、细菌转化、凝胶电泳、DNA片段的回收等，参照文献6或按供给商提供的相关说明操作。1.2.2木薯幼叶组织总RNA的提取取木薯新颖幼叶，用液氮研磨34次，用RNA提取试剂盒提取总RNA。1.2.3RT-PR扩增HNLDNA根据Haughes7等报道的木薯醇腈酶DNA序列设计RT-PR引物，由上海基康生物合成。其中上游引物设计ER酶

8、切位点，下游引物引入BaH酶切位点，详细序列如下:aattttg-3gatag-3RT-PR那么参照试剂盒说明书按以下方法进展：5030in合成DNA第一链后，直接参加试剂盒提供的专一性TaqDNAplyerase进展PR反响，PR参数为：94预变性3in后，按94变性1in，57复性1in，72延伸1in,进展30个循环，然后于72再延伸10in。1.2.4DNA序列的测定用ABI377全自动测序仪测序。1.2.5表达载体的构建用质粒提取试剂盒分别提取约20g重组质粒和表达质粒pPI3.5K，分别经ER、BaH双酶切，并用连接酶连接，转化大肠杆菌J109感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素的LB

9、平板，培养过夜。2结果2.1木薯HNLDNA的克隆及序列测定从木薯幼叶组织提取总RNA为模板(图1)，按材料和方法中所述条件进展反转录，再进展PR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测PR扩增产物，检测到一条约0.8kb的DNA片段，正好与预期的扩增片段相符图2。Lane3:18SRNAand28SRNARNAfassavaleave图1木薯幼叶组织总RNA的电泳Fig.1EletrphresisanalysisfRNAfassavaleaveRT-PR产物经BaH和ER酶切，和经同样酶切处理的pBS连接，转入E.liJ109，挑选重组质粒，通过酶切鉴定(图2)，获得阳性克隆，命名为pBS-HNL。对插入

10、的片段进展DNA序列测定(图3)。该DNA序列实际长度为777个碱基，编码258个氨基酸，与来自木薯的醇腈酶e-HNL10基因的DNA序列相比7，123，252，373，435，628，660，683位的碱基T，G，A，分别被，G，T，A，A，T，T所代替，导致125，210位的氨基酸leu,val变为phe，Ile；与程树华等报道的醇腈酶lnhnlDNA序列8比拟：337，373，435，476，628，634，636，660，683位的碱基A，T，G，T，A，A，分别被G，T，A，A，A，T，T，T所代替，导致113，125，158，210位的氨基酸：Ser，leu，phe，val变为Gl

11、y，phe，Tyr,Ile。转贴于论文联盟.ll.Lane1:DNA/HindIIIarker;Lane2:RT-PRprdutLane3:pBS/ERI;Lane4:pBS-HNL/ERIBaHI图2电泳分析RT-PR产物及限制酶切分析阳性克隆Fig.1EletrphresisanalysisfprdutbyRT-PRandanalysisfpsitivelningbyrestritiveenzyetehnique2.2表达载体的构建为了在甲醇酵母中表达木薯HNL，根据质粒pPI3.5K限制酶分布位点的特点，设计如下引物：a-3at-3其中上游引物引入BaH酶切位点，下游引物加上ER位点，以

12、质粒pBS-HNL为模板进展PR扩增，得到两端分别含有BaH、ER酶切位点的HNL片段，将其双酶切后与经同样处理的pPI3.5K连接，转化大肠杆菌J109感受态细胞，涂布含有氨苄的LB平板，培养过夜，待长出单菌落后，挑取单菌落于液体LA中，培养16h，提取质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳，选取增大的质粒DNA，为可能的重组子。用限制性酶BaH和ER进展酶切鉴定，酶切产生了0.8Kb的片断，与预期相符图4。证明为所需的重组子，命名1道:经Hind酶切的DNA标准;2道:无;3道:pPI3.5K-HNL/BaH+ER;4道:pPI3.5K-HNL/BaH图4酶切鉴定重组子pPI3.5K-HNLFig.4

13、RegestindetetinfpPI3.5K-HNL为pPI3.5K-HNL，其构建流程见图5。图5重组质粒pPI3.5K-HNL的构建流程Fig.5TheursefnstrutinfrebinantplasidpPI3.5K-HNL3讨论已有的研究结果说明，木薯基因组中含有多个HNL基因成员，已确定序列的有至少3个成员，包括ehnl10,ehnl14,ehnl24以及lnhnl可能为新成员。将本研究获得的醇腈酶DNA与已报道的，同源性较高的序列进展了序列比拟，结果显示与e-HNL10DNA序列的同源性为99.1%，氨基酸序列同源性为98.8%，与lnhnlDNA序列的同源性为98.8%，氨

14、基酸序列同源性为98.1%。但根据同源性比拟结果，我们还不能确定本研究中克隆的HNL属于其中的哪一类成员。甲醇酵母pihiapastris表达系统是一种较好的外源基因表达系统，它的蛋白质加工方式和高图3克隆的木薯HNLDNA序列及推测的氨基酸序列Fig.3Nuletideanddeduedainaidsequenesf-hydrxynitrilelyaseDNAfrassava阴影局部表示:克隆到的木薯HNLDNA序列与e-HNL10DNA相比,碱基对不同的局部;黑体局部表示：与lnhnlDNA相比,碱基对不同的局部.方框局部表示:根据克隆的木薯HNLDNA序列所推测的其氨基酸序列与e-HNL

15、10相比不同的局部;下划线表示:与lnhnl相比不同的局部。Shad:thedifferentpartfbasepairsparedte-HNL10DNA;Blak:thedifferentpartfbasepairsparedtlnhnlDNA;Pane:thedifferentpartfdeduedainaidsequenesparedte-HNL10;Underline:thedifferentpartfdeduedainaidsequenesparedtlnhnl.等真核生物相似，为理想的高等真核蛋白表达系统9。目前国外从多种植物中克隆了HNL基因,其中Hasslaher等将来自三叶胶

16、的HNLDNA分别在大肠杆菌、酿酒酵母和甲醇酵母中实现了表达，研究结果说明三叶胶HNLDNA在甲醇酵母中表达量最高，目的产物可达可溶性总蛋白的30%10；而Haughes等在大肠杆菌中表达了来自木薯的hnl基因11。国内也有研究报道在大肠杆菌中表达木薯HNL基因，酶活力为2100U/L发酵液8，但无在甲醇酵母中表达的报道。为了进一步进步木薯HNL的表达量，本项研究将木薯HNL插入到甲醇酵母pPI3.5K中，成功构建甲醇酵母表达载体，下一步将构建工程菌，完善发酵条件，以实现木薯HNL的高效表达。【参考文献】1Beke，.SterespeifiSynthesisf-hydrxyNitrilesan

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18、etri-BndFratinJ.urrpinhe，Bil，2000，4：103-109.5EInhardHasslaher，ihaelShall，arianneHayn.High-levelIntraellularExpressinfHydrxynitrileLyasefrtheTrpialRubberTreeHeveaBrasiliensisinirbialHstsJ.PrteinExpressinandPurifiatin，1997，11：61-71.6美J、萨姆布鲁克，D.拉塞尔.分子克隆实验指南黄培堂，等.译，第三版，北京：科学出版社，2022，2-400.7Hughes.J，arvalh，F.J.P.de.Hughes.A.Purifiatin,harateri-zatin，a