定量PCR基本原理及方法课件

1、定量PCR基本原理及方法基因有限公司 黄妤荧光定量PCR基本原理荧光定量PCR标记方法荧光定量PCR不同方法学的应用内容 定量PCR技术的产生1992年由Higuchi等：使用EB加入PCR反应体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度染料荧光强度间接反映核酸的量后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB荧光定量PCR基本原理 荧光定量PCR的定量原理Y：扩增产物数量X ：起始模板数量n：扩增循环数Y=X*2n= (1+ Ev)Y=X*(1+Ev)n 荧光定量PCR的定量原理1. 终点法定量原理前提：循环次数n一定、假定Ev相同原理：根据扩增产物的Y量计数反应

2、物中初始模板X的量，即：lnX=lnY-n*ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数)2. 实时检测法定量原理前提：扩增产物量相同、 Ev相同原理：反应物中原始分子数X与其所需要的扩增循环次数n成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgYn*Lg(1+Ev)=b n*a (a、b为常数)LgX =b Ct*a 模板的Ct值与其起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。 Ct值与起始模板的对应关系Y轴Ct值X起始拷贝数的对数100610051004100310021001高低低高Ct标准曲线由系列

3、稀释的已知浓度的样品做标准曲线计算待测样品的初始模板浓度 LgX =b Ct*a 绝对定量未知浓度的样品与标准曲线相比较X1X2Ct1Ct2双链DNA 内掺染料EB （第一代）SYBR Green 1（第二代）LC Green Plus（第三代）第一代常规双链DNA内掺式染料： 溴化乙锭 (EB)首个应用于均一实时检测的方法Russell Higuchi et al. 1992Simultaneous amplification and detection of specificDNA sequences. BioTechnology 10:413417荧光信号随双链DNA和出现而增强信号弱，

4、并且EB对PCR扩增有毒性已不再使用第二代常规双链DNA内掺式染料： SYBR Green I价格便宜，使用简便更亮 效果优于EB广泛应用可用于熔解分析 + 电泳分析5353SGExcitationSGSGSGSGEmission内掺式染料 SYBR-Green I 5353SGSGSGSGSGExcitationEmission内掺式染料 SYBR-Green I 外来光能荧光共振能量传递（FRET）原理所有基于寡核苷酸的方法的共同基础R = 报告基团Q = 淬灭基团RQRQRQ靠近时发生能量转移报告基团信号减弱，淬灭基团信号增强(Frster Ann. Phys. 1948)FRET =

5、Frster Resonance Energy Transfer through space基于水解探针的标记方法TaqMan (5 nuclease assay)TaqMan MGBRQ53535353ExcitationRQQRQRExcitation基于水解探针的标记方法TaqmanR = 报告基团Q = 淬灭基团TaqMan 探针特点：淬灭基团通常用TAMRA(染料) 标记，TAMRA有很强的荧光TAMRA 荧光导致人们无法使用该波长范围的其它报告染料用于多通道实验探针长度可能超过30 (探针 TM 通常 70 )当探针长度超过30bp，TM 就无法被准确计算，从而需要进行特殊设计长探

6、针不易于目标序列结合长探针可表现出显著的错配现像RQ = TAMRA3探针GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACACAGGCCTTGAGAGATATR|Q基于水解探针的标记方法TaqMan MGB 探针第二代水解探针，特点： 1. 用一个分子钳控制较小的探针大小 2. 用一个非荧光淬灭基团来取代TAMRA荧光基团AGGCCTTGAGAGATATRQ(非荧光淬灭基团) NFQQMGB(DNA小沟结合物)双链DNA小沟上的MGB钳模型更好的设计灵活性和更短的扩增子25bp15bp20bpTaqMan MGB 探针个体小TAMRA 探针 38-mer: ACTTTTCTGT

7、AAGTAGATATAACTTTTCAAAAAGACAG平行的 MGB 探针 17-mer:CTGTAAGTAGATATAACQIAGEN Quantiprobe MGB assay*超级碱基： SuperA SuperT互补的碱基形成特别牢固的键（类似于G-C键）以提高杂交性能使用于Taqman相同的*基于杂交探针的标记方法带有 MGB 钳的杂交探针基于杂交探针的标记方法 LNA 寡分子 Locked Nucleic Acid primers and probes（锁定的核酸引物及探针）什么是 LNA?LNA 是一种新型的核酸类似物，它含有一个 2-O和一个 4-C 亚甲基桥。这个桥限制了呋

8、喃核糖环的活动性，并将结构固定于一个坚固的双环构象中， 从而提供了更强的杂交表现和额外的生物稳定性 卓越的杂交特性+加强的生物稳定性 与MGB寡分子相似的效力 免费设计服务引物，TaqMan 探针 (FAM, JOE, TAMRA BHQ1 etc),分子信标, Scorpions, LightCycler 探针等RQExcitationXRQQRExcitationEmission基于杂交探针的标记方法分子信标分子信标特点：最佳信标杆的设计是至关重要的，必需能够折叠成正确的结构否则荧光基团如不能立即靠近淬灭团，会导致高背景信号。如果干的信标杆杂交太强则会影响与目标序列的退火。因此，对于每一个

9、分子信标都必需执行热变性步骤以确定他们的熔解特性。随着循环的进行，背景信号可能会因探针的水解而增加。Beacon Designer 软件可从 Premier Biosoft公司购买: Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer基于杂交探针的标记方法荧光共振能量传递双功能引物/探针分子免费设计软件“Scorpio”可从DNA Software获得：基于杂交探针的标记方法 蝎子引物基于杂交探针的标记方法 蝎子引物反应机理：Step 1: 引物在目标DNA上延伸Step 2: 到达变性温度时，淬灭基团脱落Step

10、 3: 降温过程中，探针序列与特定目标序列结合，没有延伸的引物信号被淬灭+探针 靶序列+ 结合时荧光信号淬灭基于杂交探针的标记方法置换探针Yin-yang probe陰陽蛇基于引物的标记方法Amplifluor Probe535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQR设计软件：RQXExcitationEmissionRQQRExcitation3基于引物的标记方法LUX引物/lux免费设计软件：LUX Designer标记FAM 或JOE，无需淬灭基团，发夹结果中C碱基作为淬灭基团基于引物的标记方法的特点：信号产生于与标记引物结合的所有产物它同样可以是引

11、物二聚体和非特异性扩增产物不像探针方法可提供客户的特异性保证验证有报告称，这种方法的信号相对较弱需要特殊的设计软件或设计服务非PCR的方法例：3rd Wave公司的DNA Invador非PCR的方法Invader assay 用于SNP检测TWT target53第 1 步 探针寡分子与目标杂交 NInvader probe5ATarget probeflap53NTAWT targetInvader probeTarget probeflap55533非PCR的方法Invader assay 用于SNP检测第 1 步 形成三聚体结构 3剪切酶执行切割NTAWT targetInvader

12、probeTarget probeflap55533第 1 步 剪切酶定位于三聚体结构上 非PCR的方法Invader assay 用于SNP检测NTWT targetInvader probeTarget probe5533A53flap非PCR的方法Invader assay 用于SNP检测第 1 步 “flap”序列被释放 (rate = 1000/hr/template 63 oC)TAReporter casette55RQA53flap第 2 步 释放的被设计为与完整的报告模块（reporter cassette）相杂交(由于FRET效应，报告荧光的信号减弱)非PCR的方法Inva

13、der assay 用于SNP检测ATAflap555剪切酶执行剪切QRReporter casette非PCR的方法Invader assay 用于SNP检测第 2 步 剪切酶再次定位于重叠结构上ATAflap555报告荧光信号增架(不再发生淬灭效应)QRReporter casette非PCR的方法Invader assay 用于SNP检测第 2 步 报告染料生模块（casette）上释放Invader assay 优点：均一且等温的反应 (无需循环)无需核苷酸 (没有携带污染的风险)只依赖于结构化学反应不依赖于兼容多重反应反应特异性的寡分子是非标记的缺点：噪音（高背景信号会引发问题）并非

14、所有的实验都能成功（设计的问题）荧光定量PCR不同方法学的应用 研究目的 标记方法 定量分析（基因拷贝数的绝对定量，基因表达调控的相对定量） Sybr-Green (LC Green), Taqman, etc 研究目的 基因型分析（SNP、突变型分析） Taqman, Molecular Beacon, FRET, HRM 熔解曲线分析 Sybr-Green, HRM, Molecular Beacon, FRET某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达检测结果 （自备标准品，检测样品做复管） 定量分析绝对定量某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分

15、析，下图为用Ct法得出的分析结果 。（自备标准品，检测样品做3次重复复管）HouseKeeper GeneGene of Interest 定量分析相对定量根据熔解曲线区分样品：等位基因区分、扩增特异性检测等低引物浓度 (50 nM)电泳图上的单个条带实际含有两种基因型(等位基因含有不同序列)高引物浓度 (900 nM)引物二聚低在较低温度处显示为第三条带(短片段更快溶解) 熔解曲线分析Sybr-Green I利用Sybr-Green I溶解曲线进行实验条件的优化（RG3000）Annealing at 60Annealing at 63 熔解曲线分析Sybr-Green I 基因型分析利用扩

16、增信号的种类来分型 Taqman根据熔解曲线的不同来分型 FRET, Molecular Beacon HRM双Taqman探针法检测野生型和突变型 在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个突变型探针以一种荧光素（Flr）标记，而野生型探针则用不同的荧光物（Tet）标记。如果只有一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效地扩增出来，则样本为杂合型。 利用扩增信号的种类来分型杂合型野生型突变型FRET探针进行熔解曲线分析确定基因型 FRET探针与模板结合时，因共振能量的传递而信号增强，而当在Tm 值时，FRET探针与PCR产物分开，荧光信号减弱。通过实时捕捉到的PCR产物在熔解过程中荧光信号的变化，得到PCR产物的熔解曲线。因为发生基因突变的PCR产物有特定的Tm 值，通过测定探针与PCR产物分开时的熔解温度Tm值，就能确定样品的基因型。 利用熔解曲线检测基因突变杂合型野生型突变型利用饱和染料运用HRM高分辨率熔解曲线对样品的