上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制培训课件

1、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）EMT概念对上皮间质转化概念的进一步重新被认识近年成为肿瘤研究热点之一1上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022上皮-间质转化（epithelial-mesenchymaEMT概念 EMT是指在特定的生理和病理情况下，具有极性的上皮细胞向具有移行能力的间充质细胞发生转化的现象。 EMT是一种基本的生理病理现象，是胚胎发育中及形态发生过程中的重要组成部分。2上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022EMT概念 EMT是指在特定的生理和病理情况下，具对上皮间质转化概念的进一

2、步重新被认识多种生长因子和转录因子相关；可以通过多种信号转导通路起作用；在胚胎发育、损伤修复起重要的作用；肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。3上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022对上皮间质转化概念的进一步重新被认识多种生长因子和转录因子相 EMT的标志性变化 立方上皮失去细胞间相互作用；立方上皮细胞的细胞角蛋白结构改变，外形演变为纺锤形纤维细胞形态；上皮细胞表型丧失，从而获得间质细胞表型。4上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022 EMT的标志性变化 立方上皮失去细胞间相互作用；4上皮间质发生EMT后标志物变化-表达下调：E-钙黏蛋白（E-cadherin）-连

3、环素（-catenin）-连环素（-catenin）-连环素（- catenin）桥粒斑蛋白紧密连接蛋白(ZO-1)角蛋白黏蛋白等5上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022发生EMT后标志物变化-表达下调：E-钙黏蛋白（E-ca发生EMT后标志物变化-表达上调波形蛋白（Vimentin）、纤维连接蛋白、N一钙黏蛋白、-SMA等6上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022发生EMT后标志物变化-表达上调波形蛋白（Vimentin发生EMT后标志物变化-表达上调Snail、Slug、TwistRho成纤维细胞特异蛋白(FSP1 )转化细胞生长因子(TGF-）成纤维细胞生长

4、因子（FGF) 基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、-9(MMP-9)I型胶原、型胶原7上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022发生EMT后标志物变化-表达上调Snail、Slug、Tw上皮母细胞EMT中胚层的原始间充质细胞MET次级上皮细胞中胚层其他结构细胞内胚层其他结构细胞上皮间质转化间充质细胞向上皮细胞转变EMT与胚胎发育 在胚胎三胚层结构的形成中起作用 EMT8上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022上皮母细胞EMT中胚层的原始MET次级上皮细胞中胚层其他内胚EMT调节着哺乳动物的胚胎发育器官形成：与原肠胚、四肢以及肺、肾、胃、心等器官的形成有关。胚层分化：E

5、MT与体壁内胚层和中胚层的分化，以及定形内胚层的形成有关。神经系统分化：EMT促进了背神经上皮细胞向神经管嵴细胞的转化，进一步引起背神经上皮细胞向外周神经系统中的多种神经元细胞、神经胶质细胞、色素细胞以及心脏、面颊、颈部的结缔组织的分化。9上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022EMT调节着哺乳动物的胚胎发育器官形成：与原肠胚、四肢以及肺EMT与肿瘤的侵袭转移EMT在成年人中不会广泛存在，然而在肿瘤发生过程中，EMT 使得原本没有侵袭和迁移能力的细胞获得浸润转移的能力，最终转移到其他组织或器官。众多的研究表明，EMT的发生过程是由细胞外的信号通过与细胞表面特异性受体结合而将信号转

6、入细胞内，通过多种细胞内信号转导机制调控，如胞内的Ras、Src、Rho、PI3K、Wnt等信号转导途径，活化不同的核内转录因子，最终调解转导基因的表达。EMT的发生是一个动态的过程，它涉及到许多生长因子及多个信号转导通路，各个通路间相互作用，相互影响，形成一个复杂的网络系统。10上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022EMT与肿瘤的侵袭转移EMT在成年人中不会广泛存在，然而在肿肿瘤EMT的发生机制 生长因子在EMT中的作用肝细胞生长因子（HGF）表皮生长因子（EGF）转化生长因子（TGF-）血管内皮生长因子（VEGF）等 可以诱导EMT发生，也可以引起细胞增殖，这取决于局部微环

7、境与信号分子之间的作用。11上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022肿瘤EMT的发生机制 生长因子在EMT中的作用11上皮间质转络氨酸激酶 EGF受体EGF FGF受体FGF细 胞细 胞12上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022络氨酸激酶 EGF受体EGF FGF受体FG肿瘤EMT的发生机制转录因子在EMT中的作用Snail/Slug ：属于锌指蛋白Snail超家族，它们通过同Smad相互作用蛋白(SIP1)竞争性结合E-钙黏蛋白启动子区的E-box连接基序，抑制E-钙黏蛋白的表达以及诱导波形蛋白表达水平的上升，从而诱导EMT的发生。Twist：属于碱性螺旋-环-

8、螺旋蛋白家族，是一个高度保守的转录因子，可以诱导EMT的发生, 调节胚胎发育中的组织重建，并赋予细胞迁徙能力。核因子-B（nuclear factor kappa B, NF-B）可与vimentin基因启动子调节序列结合，促进Twist表达，诱导EMT的发生，在EMT的发展和维持过程中，NF-B是必须的，抑制NF-B可以阻止EMT的发生，相反的，激活NF-B则可促进上皮细胞向间质细胞发生转变。13上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022肿瘤EMT的发生机制转录因子在EMT中的作用13上皮间质转化诱导EMT的信号通路 TGF-信号通路受体络氨酸激酶Ras-MAPK通路Src激酶通

9、路Wnt信号通路P13K/AKT途径Rho信号通路 14上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022诱导EMT的信号通路 TGF-信号通路14上皮间质转化在肿诱导EMT的信号通路 TGF-信号通路 胞外信号可以诱导上皮细胞发生EMT。这些细胞外信号包括细胞外基质分子(胶原，可溶性因子如上皮细胞生长因子EGF、转化生长因子TGF-、胰岛素样生长因子IGF、成纤维细胞生长因子FGF、肝细胞生长因子HGF等)，均能诱发肿瘤细胞内的信号级联反应，促进EMT的发生。TGF-主要通过各整合素信号传导途径发挥作用，促进Smad3分子依赖的细胞转录过程，也可以通过非Smad分子依赖的P38MAP激酶

10、途径及GTP酶介导的信号转导途径发挥作用。根据组织类型的不同，三种TGF-均可参与EMT的诱导机制。特别注意的是TGF-在肿瘤中扮演着双重角色:一方面，它作为一种肿瘤生长抑制因子，能抑制原位肿瘤细胞的增殖，诱发衰老和凋亡来阻止肿瘤的生长;另一方面，在肿瘤的侵袭和转移过程中，TGF-却扮演着肿瘤生长促进因子的角色，不但促使细胞周期阻滞，加速凋亡，还能诱导维持EMT状态。15上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022诱导EMT的信号通路 TGF-信号通路15上皮间质转化在肿诱导EMT的信号通路受体络氨酸激酶Ras-MAPK通路 受体络氨酸激酶是一类小GTP结合蛋白超家族，共包括6个成员

11、：Ras、Rab、Ran、Rho和Rad/Gem/Kir(RGK)，它是一类具有络氨酸激酶活性的受体，激活后通过一系列蛋白使G蛋白Ras或MEKKs等激酶活化，由此将细胞外信号转入核内，通过级联反应起MAPK途径的激活。MAPK参与到很多生物反应的调节中，包括细胞增殖，整合素介导的细胞黏附，细胞分泌作用，神经元分化，卵母细胞成熟，B、T细胞分化，以及细胞扩散。在Ras效应物中，丝氨酸/苏氨酸酶Raf信号反作用于TGF-的生长抑制和诱导凋亡的作用，强化TGF-的致侵袭效应。另外，MAPK家族中的JNK和P138磷酸化也影响细胞的表型转化。16上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022

12、诱导EMT的信号通路受体络氨酸激酶Ras-MAPK通路16上诱导EMT的信号通路Src激酶通路 Src是一种原癌基因，属于非受体络氨酸激酶家族，主要调节与形态发生有关的许多生物功能，包括上皮细胞极性，细胞间黏附及恶性表型的形成。除此之外，Src家族还与EGF和集落刺激因子诱导的有丝分裂过程有关。Src家族激酶至少包括9个成员，每个成员都含有一个SH2和一个SH3结构域。SH2在信号转到中扮演重要的角色，而SH3在细胞骨架重建方面有重要的意义。其中Src、Fyn、Yes在大多数组织中都有表达，而其余成员在特定的组织选择性表达。在结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中发现Src的异常激活和肿瘤的侵袭转移有

13、关。17上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022诱导EMT的信号通路Src激酶通路17上皮间质转化在肿瘤转移诱导EMT的信号通路Wnt信号通路 高度保守的Wnt/-连环素途径在胚胎发育和肿瘤中起重要作用。它由Wnt蛋白、卷曲蛋白、散乱蛋白、APC复合物、连环素、TCF/LEF转录因子家族组成。Wnt结合卷曲蛋白受体后，散乱蛋白被磷酸化激活，并与Axin发生直接作用，APC复合体解体，GSK-3无法磷酸化-连环素，从而阻止-连环素降解。当-连环素积聚到一定水平时，直接进入细胞核，与转录受体TCF/LEF结合，促进靶基因的表达.。当-连环素的酪氨酸磷酸化后即与Caderin-Cate

14、ninCompex (CCC)分离，由于上皮钙黏蛋白失去与连环素的锚连接而形成一种“活动”形式，因而从细胞内连接处重分布到别的区域，失去黏附功能，导致细胞分散增加，移动力加强和发生侵袭。18上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022诱导EMT的信号通路Wnt信号通路18上皮间质转化在肿瘤转移诱导EMT的信号通路P13K/AKT途径 PI3K和AKT是促进抗细胞凋亡的重要调节因子。 AKT一旦被激活便可以介导很多靶基因的活化和抑制，从而影响细胞的生存、生长、增殖、细胞骨架的构成等。它涉及细胞周期、细胞增殖、细胞存活、新陈代谢和EMT。 EMT被活化的AKT诱发引起一系列的改变: (1

15、)细胞黏附的丢失;(2)形态学的改变;(3)极性消失;(4)细胞运动能力诱发;(5)细胞黏附力下降;(6)特殊蛋白质产物或分布的改变，如desmoplakin等。 19上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022诱导EMT的信号通路P13K/AKT途径19上皮间质转化在肿诱导EMT的信号通路Rho信号通路 Rho家族是诱导张力纤维形成、调控细胞骨架蛋白、细胞黏附和细胞能动性的主要分子 目前已离出16种，众多研究集中在Cdc42、Racl和RhoA。Cdc42促进成纤维细胞丝状伪足的形成，Racl则能调节层状伪足的生成及膜皱缩，RhoA可以促进张力纤维的装配。 IQGAP是Rho家族的

16、效应物之一，它直接与-cat及E-cad的胞浆部分互相作用，将其连接在肌动蛋白骨架上。IQGAP的-cat结合区域有部分与-cat结合区域相重叠，因此可以导致-cat从cat-cat复合物上分离下来，引起与肌动蛋白骨架连接的断裂，细胞黏附力下降，运动能力增强。20上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022诱导EMT的信号通路Rho信号通路20上皮间质转化在肿瘤转移EMT的分子机制21上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022EMT的分子机制21上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10EMT在肿瘤中作用的研究进展肿瘤的转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，大多数癌症患者并非死于

17、原发性肿瘤而死于转移癌。目前已知肿瘤侵袭转移能力有赖于肿瘤细胞和促进肿瘤细胞生长、生成、血管生成、侵袭、转移等内环境因素的相互作用，其中EMT是肿瘤侵袭转移的主要因素之一。22上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022EMT在肿瘤中作用的研究进展肿瘤的转移是恶性肿瘤的重要生物学在恶性肿瘤的发生发展过程中，肿瘤细胞在生物学上表现出一定的异质性，其浸润区较瘤体中央的细胞更反映出肿瘤的生物学行为，具有比瘤体中央区细胞更强的运动力和侵袭性。许多国内外的科学家，经过大量研究证实，在包括结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、及宫颈癌等多种肿瘤侵袭转移过程中均观察到EMT的发生，而且肿瘤组织中发生EM

18、T的瘤细胞数目直接与病变组织的侵袭转移程度相关。EMT可能在肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用，是启动恶性肿瘤侵袭转移的重要途径之一，还有许多临床病理研究均支持这一观点。EMT在肿瘤中作用的研究进展23上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022在恶性肿瘤的发生发展过程中，肿瘤细胞在生物学上表现出一定的异小结EMT在胚胎发育时期的组织器官形成、成体后组织改建、创伤修复中发挥着重要的作用，同时在慢性病的发生，尤其是肿瘤的侵袭转移中的作用也备受关注。恶性肿瘤是一个动态发展的过程，不仅包括了基因的改变，还有肿瘤微环境的调节。EMT的发生能够使得连接紧密的上皮细胞获得迁徙能力，成为易于游走的间

19、质细胞，到达靶器官后再通过间质-上皮转化（MET）形成与原发灶相同的肿瘤，成为转移性癌。鉴于EMT在原发性肿瘤细胞迁徙到循环系统或淋巴系统中扮演着重要的角色，研究EMT的发生机制以及其调节因素在肿瘤的生长、逃逸、转移中的作用，及如何阻断这一机制的发生就显得尤为重要。24上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022小结EMT在胚胎发育时期的组织器官形成、成体后组织改建、创伤问题1 什么是上皮间质转化？2 发生上皮间质转化的标志性变化？3 上皮间质转化时发生变化的标志物有哪些？25上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022问题1 什么是上皮间质转化？25上皮间质转化在肿瘤转移

20、中的作转录因子Twist调控胃腺癌细胞转移、增殖及抗凋亡能力的分子机制26上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022转录因子Twist调控胃腺癌细胞转移、增殖及抗凋亡能力的分研究背景1669bp609bpCAX repeatbHLH domain27上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022研究背景1669bp609bpCAX repeatbHL研究背景28上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022研究背景28上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2研究背景Twist及EMT相关分子的临床意义TwistE-cadherinVimentin正常胃癌29

21、上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022研究背景Twist及EMT相关分子的临床意义TwistE-cHGC-27（未分化）Akagi T, Kimoto T. Human cell line (HGC-27) derived from the metastatic lymph node of gastric cancer. Acta Med Okayama 1976; 30:215-9. MGC-803 （低分化）Wang K. A in vitro cell line(MGc80-3) of a poorly differentiated mucoid adenocacinom

22、a of human stomach. Acta Biologiae Experimentalis Sinica 1983; 16:257-67. BGC-823 （低分化）Deng GR, Lu YY, Chen SM, Miao J, Lu GR, Li H, Cai H, Xu XL, E Z, Liu PN. Activated c-Ha-ras oncogene with a guanine to thymine transversion at the twelfth codon in a human stomach cancer cell line. Cancer Res 1987

23、; 47:3195-8.SGC-7901（高分化）Lin CH, Fu ZM, Liu YL, Yang JL, Xu JF, Chen QS, Chen HM. Investigation of SGC-7901 cell line established from human gastric carcinoma cells. Chin Med J (Engl) 1984; 97:831-4. 技术路线筛选细胞系30上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022HGC-27（未分化）Akagi T, Kimoto T. 技术路线分子机制探讨Western-blotRT-PCR验证RT

24、-PCR细胞侵袭能力检测细胞周期变化检测细胞抗凋亡能力检测细胞形态变化检测鉴定差异表达的肿瘤相关基因鉴定Twist表达被稳定抑制的细胞克隆检测Twist在细胞中的过表达水平RNAiOverexpression筛选细胞系31上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022技术路线分子机制探讨Western-blotRT-PCR验证实验材料试剂盒：ECL试剂盒购自Amersham公司；转染级质粒的提取试剂盒、大肠杆菌质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；DNA片段回收试剂盒、逆转录试剂盒购自Invitrogen公司；质粒载体系统：用于RNAi：pSUPER-Retro-Nero vector

25、system 用于过表达：pcDNA3.1 vectorpGEM-T easy vector抗体：抗Twist、抗vimetin抗体和抗AKT2多克隆抗体，抗-catenin单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology；抗p53、抗E-cadherin、抗N-cadherin和抗-integrin单克隆抗体购自北京中杉金桥；抗GAPDH单克隆抗体购自上海康成生物技术有限公司。 主要仪器和设备：倒置相差显微镜（Olympus）、流式细胞仪（BD Bioscience）、PCR 基因扩增仪（PE和Themo）、紫外成像仪及照相系统（Eagle Eye）、蛋白电泳仪及转印系统（Bi

26、o-Rad） 、CO2培养箱（SANYO） 32上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022实验材料试剂盒：ECL试剂盒购自Amersham公司；质粒载Twist对胃腺癌细胞转移、增殖和活力的影响结 果33上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022Twist对胃腺癌细胞转移、增殖和活力的影响结 果33Twist及标记分子在4个胃腺癌细胞系中的表达水平结 果34上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022Twist及标记分子在4个胃腺癌细胞系中的表达水平结 结果4个胃腺癌细胞系表型及形态比较35上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022结果4个胃腺癌细

27、胞系表型及形态比较35上皮间质转化在肿瘤转移4个胃腺癌细胞系表型及转移能力比较结果36上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/20224个胃腺癌细胞系表型及转移能力比较结果36上皮间质转化在肿瘤胃腺癌细胞系中Twist过表达引起的效应结果37上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022胃腺癌细胞系中Twist过表达引起的效应结果37上皮间质转化胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应结果38上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应结果38上皮间质结果胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应39上皮间质转化在肿瘤转

28、移中的作用及机制10/2/2022结果胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应39上皮间质0 hour 12 hours 24 hours结果ShScrambleShTWIST1ShTWIST2胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应40上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/20220 hour 结果ShScrambleShTWIST1ShTWIST2胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应41上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022结果ShScrambleShTWIST1ShTWIST2胃腺结果胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应42上皮间质转化在肿

29、瘤转移中的作用及机制10/2/2022结果胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应42上皮间质结果胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应43上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022结果胃腺癌细胞系中Twist表达沉默所引起的效应43上皮间质Twist表达水平对p53蛋白的影响-Twist降低p53蛋白和mRNA在细胞内的水平结果44上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022Twist表达水平对p53蛋白的影响-Twist降低p5Twist调控表达谱的鉴定结果45上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022Twist调控表达谱的鉴定结果45上皮间质转

30、化在肿瘤转移中的Twist表达抑制前后HGC-27细胞的肿瘤相关基因表达谱46上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022Twist表达抑制前后HGC-27细胞的肿瘤相关基因表达谱4结果胃腺癌细胞中受Twist蛋白水平影响的基因表达谱47上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022结果胃腺癌细胞中受Twist蛋白水平影响的基因表达谱47上皮结果胃腺癌细胞中受Twist蛋白水平影响的基因表达谱48上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022结果胃腺癌细胞中受Twist蛋白水平影响的基因表达谱48上皮总结四种胃腺癌细胞系中的Twist表达水平与细胞的转移能力及EMT相

31、关分子的表达水平存在对应关系；Twist表达抑制时，细胞出现与EMT相反的形态学改变； 改变胃腺癌细胞系中Twist表达水平，能够显著改变细胞的侵袭能力改变胃腺癌细胞系中Twist表达水平，细胞中各种EMT相关分子标记的表达发生明显改变 。1. Twist参与调控胃腺癌细胞转移的机制49上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022总结四种胃腺癌细胞系中的Twist表达水平与细胞的转移能力及总结Twist原位癌转移癌间质细胞标记分子EMT进程FibronectinVimentinN-cadherin -integrin上皮细胞标记分子E-cadherin-catenin-catenin1. Twist参与调控胃腺癌细胞转移的机制EMT相关蛋白是Twist促进胃腺癌细胞转移的主要效应分子50上皮间质转化在肿瘤转移中的作用及机制10/2/2022总结Twist原位癌转移癌间质细胞标记分子EMT进程Fibr1. Twist参与调控胃腺癌细胞转移的机制总结Twistp53Heparanasecell adhesioncell invasioncell migrationTSP-1 Integrin KAI-1 PAI-1 Masp