HIV感染的血清学检测培训课件

1、内容HIV抗体检测：HIV抗体筛查检测HIV确认实验HIV P24抗原检测：1HIV感染的血清学检测10/2/2022内容HIV抗体检测：1HIV感染的血清学检测10/1/202HIV抗体检测全国艾滋病检测技术规范National Guideline for Detection of HIV/AIDS（2004年版）2HIV感染的血清学检测10/2/2022HIV抗体检测全国艾滋病检测技术规范2HIV感染的血清学检测HIV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查：以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。以诊断为目的的检测是为了确定

2、个体HIV感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。HIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确认试验3HIV感染的血清学检测10/2/2022HIV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查：3HIV感染的血清HIV抗体试剂盒进展代次 抗原 方法特异性检测 检测时间1 全病毒 间接 IgG 抗体HIV-1 2个月2 重组或多肽 间接 IgG 抗体HIV-1 / -2 3-4 周3 重组+多肽 夹心 IgM / IgG 抗体 4-7 天 HIV-1 / -2 / -

3、O4 抗原+抗体 夹心IgM / IgG 抗体 抗原 5pg HIV-1 / -2 / -O p24 抗原4HIV感染的血清学检测10/2/2022HIV抗体试剂盒进展代次 抗原 HIV抗体检测筛查试验5HIV感染的血清学检测10/2/2022 HIV抗体检测筛查试验5HIV感染的血清学检测10/1/2HIV抗体筛查检测程序筛查、复检、确认原理酶联免疫、凝集、层析标本血液、唾液、尿液、组织液产品ELISA、快速、简单6HIV感染的血清学检测10/2/2022HIV抗体筛查检测程序筛查、复检、确认6HIV感染的血清学筛查试剂要求HIV 混合型国家SDA生物诊断试剂注册批准批检合格临床评估质量优良

4、7HIV感染的血清学检测10/2/2022筛查试剂要求HIV 混合型7HIV感染的血清学检测10/筛查方法：常用的筛查方法是酶联免疫试验（ELISA）快速检测（RT）及其它检测 (1)明胶颗粒凝集试验(PA) (2)斑点EIA或称斑点ELISA (dot-EIA) (3)斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验 (4)艾滋病唾液检测卡尿液HIV抗体检测8HIV感染的血清学检测10/2/2022筛查方法：8HIV感染的血清学检测10/1/2022一、酶联免疫试验：ELISA 9HIV感染的血清学检测10/2/2022一、酶联免疫试验：ELISA9HIV感染的血清学检测10/1包被抗原血中抗体与抗原反应

5、显色反应酶联免疫法病毒溶解抗原、重组的衍生抗原、合成肽抗原酶联HRP、AP或化学发光10HIV感染的血清学检测10/2/2022包被抗原血中抗体与抗原反应显色反应酶联免疫法病毒溶解抗原、重（一）斑点EIA或称斑点ELISA（dot-EIA）以硝酸纤维膜为载体，将HIV抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原。加血清样品作用，以后步骤同ELISA。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10 min以内，使用抗原量少。二、快速诊断试剂11HIV感染的血清学检测10/2/2022（一）斑点EIA或称斑点ELISA（dot-EIA）二、快速（二）免疫胶体金（或胶体硒）快速试验与斑点EIA相似，也是以

6、硝酸纤维膜为载体。区别在于不用酶标记抗体，而代之以红色的胶体金（或胶体硒）A蛋白，用渗滤法作为洗涤方法。12HIV感染的血清学检测10/2/2022（二）免疫胶体金（或胶体硒）快速试验12HIV感染的血清学检稳定，可室温长期保存。试验不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测。已有被SFDA批准注册的进口试剂和国内产品。一般可在1030min内判读结果。 免疫胶体硒快速试验特点13HIV感染的血清学检测10/2/2022稳定，可室温长期保存。试验不需任何设备，迅速、简便、特异性较样品垫: 加入血浆,血清或全血样品.红细胞在此迁移过

7、程中被去除质控条:固定的含捕捉硒标物的特异性试剂,不管样品中有无被检测物都应出现红色线条.控制测试结果的有效性病人条:固定的含特异性分析试剂,任何与硒标特异性试剂结合的分析复合物在此被结合固定,形成三文治结合物,肉眼可见的红色线条说明有阳性反应连接物垫:含分析特异性试剂结合的硒标,为一种肉眼可见的红色信号,被分析物和硒标特异性试剂在此反应结合14HIV感染的血清学检测10/2/2022样品垫: 加入血浆,血清或全血样品.红细胞在此迁移过程中被去 撕下所需的测试纸条数,撕下表面保护膜15HIV感染的血清学检测10/2/2022 撕下所需的测试纸条数,撕下表面保护膜15HIV感染的血清学血清/血浆

8、样品加50ul样品于样品垫中15分钟内读取结果16HIV感染的血清学检测10/2/2022血清/血浆样品15分钟内读取结果16HIV感染的血清学检测1全血样品 加50ul样品于样品垫中手指血方法静脉血方法加一滴缓冲液15分钟内读取结果17HIV感染的血清学检测10/2/2022全血样品手指血方法静脉血方法加一滴缓冲液15分钟内读取结果1病人条质控条18HIV感染的血清学检测10/2/2022病人条质控条18HIV感染的血清学检测10/1/2022 注意事项非EDTA抗凝的血浆样品可能会 得到不正确的结果反应条颜色深浅的程度与样品中 抗体的滴度没有必然的联系 结果的判断19HIV感染的血清学检测

9、10/2/2022 注意事项非EDTA抗凝的血浆样品可能会19HIV感染的 （三）艾滋病唾液检测卡在硝酸纤维膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同时检测含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗体，原理为酶免疫间接法。主要检测唾液中的HIV IgA与IgG抗体，敏感性特异性与ELISA相近，可避免静脉穿刺。但样品预处理时间长且售价较高。以唾液为样品测定HIV抗体的ELISA、免疫印迹法（WB）试剂已经美国FDA批准。20HIV感染的血清学检测10/2/2022 （三）艾滋病唾液检测卡20HIV感染的血清学检测10/1（四）明胶颗粒凝集试验（PA）PA是HIV血清抗体检测的一种简便方

10、法，是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA试剂有两种，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂（AFD HIV-1/2 PA），已经我国食品药品监督管理局（SFDA）注册批准；HIV-1、HIV-2抗原分别致敏的PA试剂（SERODIA-HIV-1/2）可初步区分HIV-1型和HIV-2型，目前我国尚未引进。21HIV感染的血清学检测10/2/2022（四）明胶颗粒凝集试验（PA）21HIV感染的血清学检测10 尿液测定采样优点，尤其对

11、吸毒者标本机理：IgA为主，IgG少量HIV-1型抗体阳性结果务必用血清学检测22HIV感染的血清学检测10/2/2022 尿液测定22HIV感染的血清学检测10/1/2022快速试剂的应用偏远地区急诊临床（高危）职业暴露临产23HIV感染的血清学检测10/2/2022快速试剂的应用偏远地区23HIV感染的血清学检测10/1/2结果报告： 对呈阴性反应的样品，可由实施检测的实验室出具HIV抗体阴性报告。 对呈阳性反应的样品，须进行复检，不能出阳性报告。复检试验： 对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。 如果两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性

12、；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。 对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告。24HIV感染的血清学检测10/2/2022结果报告：24HIV感染的血清学检测10/1/2022初筛试验呈阳性反应样品的转送： 填写“HIV抗体待复测送检单”，经1名检验人员和1名具有中级以上技术职称的人员审核签字。送当地艾滋病筛查中心实验室，再转送艾滋病确认实验室，或在本实验室复检后直接送确认实验室。 对筛查阴性和阳性者，均需做好检测后咨询。25HIV感染的血清学检测10/2/2022初筛试验呈阳性反应样品的转送：25HIV感染的血清学检测10样本初筛检测一阴

13、一阳均阳性反应阴性报告送确认实验室确认重复检测阴性报告均阴性反应阳性反应原有试剂另一种原理初筛试剂用初筛试剂阴性反应HIV抗体初筛检测流程图26HIV感染的血清学检测10/2/2022样本初筛检测一阴一阳均阳性反应阴性报告送确认实验室确认重 初筛试验结果的报告 对HIV抗体筛查试验：“” “HIV抗体阴性”报告（可用附表“+” 不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告27HIV感染的血清学检测10/2/2022 初筛试验结果的报告 对HIV抗体筛查试验：27HIV感染的对HIV抗体筛查试验，呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报告28HIV感染的血清学检测10/2/2022对HIV抗体筛

14、查试验，呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告29HIV感染的血清学检测10/2/2022对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复30HIV感染的血清学检测10/2/202230HIV感染的血清学检测10/1/2022 HIV抗体检测确认试验 31HIV感染的血清学检测10/2/2022 HIV抗体检测确认试验 31HIV感染的血清学检测10/1HIV抗体确认试验确认试验的试剂： 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。确认试验方法： 包括免疫印迹试验(WB)、条带免疫试验(LIATEK

15、HIV)、放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA)。国内常用的确认试验方法是WB。32HIV感染的血清学检测10/2/2022HIV抗体确认试验确认试验的试剂：32HIV感染的血清学检测蛋白印迹实验（WB）广泛使用的确认实验基本原理HIV全病毒抗原经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,将分子量大小不等的HIV抗原蛋白带分离开来,然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。33HIV感染的血清学检测10/2/2022蛋白印迹实验（WB）33HIV感染的血清学检测10/1/20将待检血清样品加到硝酸纤维素膜上,恒温

16、震荡,使其充分接触反应,血清中若含有抗HIV抗体,就会与膜条上的抗原带相结合。加入酶偶联的抗人IgG抗体和底物，即可使有反应的抗原-抗体结合带呈现紫褐色,根据出现条带情况判定结果。34HIV感染的血清学检测10/2/2022将待检血清样品加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡,使其充分接触反应蛋白质抗原分子经电泳分开血液中的抗体与抗原反应，形成不同的条带Western Blot35HIV感染的血清学检测10/2/2022蛋白质抗原分子经电泳分开血液中的抗体与抗原反应，形成不同的条方法加血浆YYY洗加酶结合物(Ab-HRP) YYYYYYY洗加底物YYYYYY36HIV感染的血清学检测10/2/2022方

17、法加血浆YYY洗加酶结合物YYYYYYY洗加底物YYYYY其可检测标本中针对HIV不同抗原的抗体，故被用做确认试剂。不同的研究机构有不同的判定标准37HIV感染的血清学检测10/2/2022其可检测标本中针对HIV不同抗原的抗体，故被用做确认试剂。3WB结果判定标准无HIV-1特异性条带ENV 或ENV+p24CHINA无条带1 ENV + p24/p31FDA（USA）无条带或只有P172 ENV+GAG+POLWHO阴 性阳 性组 织“不确定”()：出现HIV-1特异性条带，但带型不足以 确认阳性，每三个月随访一次，共两次， 仍属可疑，判为阴性38HIV感染的血清学检测10/2/2022W

18、B结果判定标准无HIV-1特异性条带ENV 或ENV+HIV抗体确认实验结果a 强阳性对照（HIV-1和HIV-2）b弱阳性对照（HIV-1）c阴性对照d典型的HIV-2血清阳性反应 a b c dgp160gp120 p66p55p51 gp41p39 p31P24p17 血清对照HIV-2特异带39HIV感染的血清学检测10/2/2022HIV抗体确认实验结果a 强阳性对照（HIV-1和HIV-2不确定标本的处理原因特异性和非特异性因素标本种类，操作技术，感染时 间，指征把握等处理随访（注意一根条带）保存40HIV感染的血清学检测10/2/2022不确定标本的处理原因特异性和非特异性40H

19、IV感染的血清学试验中应注意的问题严格按照说明书操作和阅读判断结果典型带型和颜色；强调env带非典型全而淡、一根主要条带、高危人群、不确定，等等特异性高，但也有漏检核对、多种、操作技术41HIV感染的血清学检测10/2/2022试验中应注意的问题严格按照说明书操作和阅读41HIV感染的血免疫印迹法（WB，HIV-1/2混合型）HIV-1阳性反应不确定反应 出现HIV-2指示条带报告HIV-1阳性不确定反应阳性反应阴性反应报告阴性每3个月随访1次，共2次，仍属可疑，则报告阴性；如随访期间HIV抗体出现阳性反应则报告阳性。随访期间可根据需要，检测病毒核酸和或P24抗原，作为辅助诊断。阴性反应报告阴

20、性筛查试验阳性反应样品报告HIV-2血清学阳性免疫印迹法（WB，HIV-2）图2 HIV抗体确认检测流程42HIV感染的血清学检测10/2/2022免疫印迹法（WB，HIV-1/2混合型）HIV-1阳性反应不P24抗原检测43HIV感染的血清学检测10/2/2022P24抗原检测43HIV感染的血清学检测10/1/2022窗口期4th gen3rd gen= =1st-2nd genHIV antigenIgM abIgG abDetection limit= window第一/二代试剂检测IgG抗体，第三代试剂检测IgG 、IgM抗体,第四代试剂同时检测IgG、 IgM抗体和P24抗原使窗口

21、期缩短。44HIV感染的血清学检测10/2/2022窗口期4th gen3rd g窗口期窗口期的决定因素初筛试剂质量和测试技术机体免疫反应病毒特性窗口期无法避免45HIV感染的血清学检测10/2/2022窗口期窗口期的决定因素45HIV感染的血清学检测10/1/ P24抗原测定适用范围HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应， 但HIV-1抗体确认阴性者的诊断。监测病程进展和抗病毒治疗效果。46HIV感染的血清学检测10/2/2022 检测原理P24抗原的检测通常是采用ELISA夹心法，已知抗体包被固相反应板孔底，加入待测血清，若血清中含有P24抗原则与包被抗体形成抗原-抗体复合物，再加入酶（HRP）标记的HIV-1抗体与抗原结合，加底物显色，在酶标仪上读结果。47HIV感染的血清学检测10/2/2022检测原理P24抗原的检测通常是采用ELISA夹心法，已知抗体为了提高检测血清中P24抗原的敏感性，需先将血清中免疫复