实验二十五基因重组实验Ⅳ-重组体的筛选与鉴定

1、PAGE PAGE 9实验二十十五 基因重重组实验验重组体体的筛选选与鉴定定 原理理限制性内内切核酸酸酶酶切切鉴定：具体原原理见实实验二十十一。PCR反反应鉴定定：具体体原理见见实验十十八。试剂1、DNNA模板板2、引物物3、Taaq DDNA聚聚合酶4、dNNTPss（dAATP、dGTTP、ddCTPP、dTTTP）5、100PCRR 反应应缓冲液液：1000mmmol/L TTriss-HCCl ppH 88.3，5000mmool/LL KCCl，115mmmol/L MMgCll2，0.1%明明胶6、矿物物油超纯水8、EccoR I酶解解反应液液（100）: 1mool/LL pHH

2、7.55 TTriss-HCCl , 0.5mool/LL NNaCll , 0.1mool/LL MMgCll2。9、Hiind IIII酶解反反应液（10）：1mmol/L ppH7.4 TTriss-HCCl , 1moll/L NaaCl , 0.007mool/LL MMgCll2。3.500TAEE 电泳泳缓冲液液：称取取2422克Trris，加入557.11ml冰冰乙酸，1000ml 0.55moll/L EDTTA，调调节pHH至8.0，加加蒸馏水水至10000mml。10、.凝胶加加样缓冲冲液：00.255%溴酚酚蓝、00.255%二甲甲苯青FFF、440%蔗蔗糖水溶溶液（w

3、w/v）。11、11%（11.5%）琼脂脂糖凝胶胶：1TAEE 1000mll含1gg（1.55g）琼琼脂糖。器材1、DNNA扩增增仪2、电泳泳仪、电电泳槽3、微量量移液器器4、紫外外投射仪仪5、0.5mll塑料离离心管6、样品品槽模板板（梳子子）7、锥型型瓶（1100mml或550mll）8、一次次性塑料料手套9、凝胶胶成像系系统操作步步骤1. 酶切反反应体系系的建立立（200l反应应体系） 按按下表要要求配制制酶切反反应体系系质粒DNNA6l10BBufffer2lHinddIIII1lH2O10llEcoRR I1l 混混匀后置置37水浴33h。2. PCRR反应体体系的制制备(225l

4、反应应体系)按下表要要求配制制酶切反反应体系系DNA2l10BBufffer2.5ldNTPP0.1lH2O17.22lPrimmer-10.1lTaqEE1lPrimmer-20.1l50%甘甘油2l混匀后，20000rppm离心心30ssec，然后按按94 55minn94 440seec55 440seec 355cyccless72 990seec72 33minn3. 电电泳：11%琼脂脂糖凝胶胶（酶切切）和11.5%琼脂糖糖凝胶（PCRR反应）将20l酶切切和PCCR产物物进行电电泳，观观察结果果。Vocaabullaryy inn Biiochhemiicall teechnno

5、loogyAAbsoorbaancee吸光度Absoorbeent吸附剂Absoorpttionn chhrommatoograaphyy吸附层析析Absoorpttionn sppecttrum吸收光谱谱Acryylammidee, AAa/AAcr丙烯酰胺胺（单体体）Adenninee, AA腺嘌呤Affiinitty cchroomattogrraphhy亲和层析析Agarrosee琼脂糖Agarrosee geel eelecctroophooressis，AGEE琼脂糖凝凝胶电泳泳Alleele speeciffic oliigonnuclleottidee, AASO等位基因因特异

6、性性寡核苷苷酸杂交交Ammooniuum pperssulffatee, AAP过硫酸胺胺Anglle rrotoor角式转头头Anioon eexchhangge cchroomattogrraphhy阴离子交交换层析析CCarrrierr ammphoolytte载体两性性电解质质Catiion excchannge chrromaatoggrapphy阳离子交交换层析析Cellluloose aceetatte mmembbranne eelecctroo -phhoreesiss，（CCAMEE）醋酸纤维维薄膜电电泳Cellluloose ionn-exxchaangeers纤维素离离

7、子交换换剂Centtriffugee离心机Centtriffugaal fforcce离心力Centtriffugaal ttechhniqque离心技术术Coennzymme辅酶Coluumn chrromaatoggrapphy柱层析Cytoosinne, C胞嘧啶DDenaaturre ggraddiennt ggel eleetroo -phhoreesiss , DGGGE变性梯度度凝胶电电泳Deoxxyriibonnuclleicc accid, DNNA脱氧核糖糖核酸Diallysiis透析Difffereentiial cenntriifuggatiion差速离心心Discco

8、nttinuuouss PAAGE不连续聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳EElettro-osmmosiis电渗Emisssioon sspecctruum发射光谱谱Excllusiion chrromaatoggrapphy排阻层析析GGel chrromaatoggraphyy凝胶层析析Gel filltraatioon凝胶过滤滤Guanninee，G鸟嘌呤HHomoogennizeer匀浆器Holoozymmasee全酶IIon-excchannge chrromaatoggrapphy离子交换换层析Ion-excchannge gell离子交换换凝胶Ion-excchannge ressin离

9、子交换换树脂Isoeelecctriic ffocuusinng, IEFF等电点聚聚焦Isoeenzyyme同工酶LLigaand配基MMelttingg teempeeratturee, TTm溶解温度度Matrrix载体Mobiile phaase流动相Moleecullar sieeve filltraatioon分子筛过过滤NN,N,N,N-meethyylennc Bisaacryylammidee, BiisN,N,N,N-四亚甲甲基 双双丙烯酰酰胺N,N,N,N-tettrammethhyleethyylennedii -amminee, TTEMEED四甲基乙乙二胺OOsmo

10、osiss渗透PPapeer cchroomattogrraphhy纸层析Parttitiion chrromaatoggrapphy分配层析析Parttitiion coeeffiicieent分配系数数Phottoellecttricc coolorrimeetryy光电比色色法Plassmidd质粒Polyyacrrylaamidde ggel eleectrrophhoreesiss, PPAGEE聚丙烯酰酰胺凝胶胶Polyymerrasee chhainn reeacttionn, PPCR聚合酶链链反应Primmer引物RRelaativve ccenttriffugaal ffo

11、rcce, RCFF相对离心心力Resttricctioon eendoonuccleaase ，REE限制性内内切酶Resttricctioon ffraggmennt llenggth pollymoorphhismm, RRFLPP限制性片片段长度度多态性性Ratee zoonall ceentrrifuugattionn速率区离离心法Reveersee ossmossis反向渗透透Revooluttionn peer mminuute ,rppm每分钟转转速Riboonuccleiic aacidd, RRNA核糖核酸酸Rotoor转头SSalttingg inn盐溶Salttingg

12、 ouut盐析Saphhadeex葡聚糖凝凝胶SDS-PAGGESDS-聚丙烯烯酰胺凝凝胶Sediimenntattionn cooeffficiientt 沉降系数数Sediimenntattionn veeloccityy沉降速率率Sediimenntattionn tiime,ST沉降时间间Sephharoose琼脂糖凝凝胶Sequuenccingg测序Singgle strrandd coonfoormaativve ppolyymorrphiism, SSSCP单链构象象多态性性Sodiium doddecyyl ssulffatee, SSDS十二烷基基硫酸钠钠Specctroophootommeteer分光光度度计Specctroophootommeteery分光光度度法Stattionnaryy phhasee固定相Swinng-oout rottor水平式转转头TThinn-laayerr chhrommatoograaphyy, TTLC薄层层析析Trannsmiittaancee透光率Thymmin