催化水解反应金属酶

1、关于催化水解反应的金属酶第1页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四根据酶催化反应的类型，把酶分为六类 ：氧化还原酶类 催化氧化还原反应转移酶类 催化功能基团转移反应裂解酶类 催化从底物移去一个基团而留下双键的反应或其逆反应异构酶类 催化异构体互相转变合成酶类 催化双分子合成一种新物质同时使ATP分解的反应水解酶类 催化水解反应第一节 概述第2页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四一、水解酶 六大酶类之中研究的最多并应用最广泛的一类，其中有不少水解酶的活性与金属离子有关。 后页表中列出若干水解金属酶和金属离子激活酶。 金属离子激活酶是指必须加入金属离子才具有活

2、性的酶。第3页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四第4页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四水解酶根据水解键的类型不同分为六个亚类。酯酶 作用于酯键，使其水解为酸和醇糖苷酶 作用于糖基化合物，使糖键水解醚酶 作用于醚键，使其水解肽酶 作用于肽键，使其水解C-N酶 作用于其它C-N键酸酐酶 作用于酸酐本章仅对肽酶及酯酶作一些介绍 第5页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四肽酶催化蛋白质的肽键水解蛋白质为高分子物质，不能透过细胞膜，必须水解成小分子才能被肠吸收。蛋白质由各种肽酶催化，水解成小分子，被肠吸收。第6页，共40页，2022年，5月20

3、日，8点55分，星期四肽酶肽链端解酶肽链内切酶（蛋白酶）氨肽酶羧肽酶嗜热菌蛋白酶根据作用方式，肽酶又分为肽链端解酶和肽链内切酶。肽链端解酶从肽链羧基末端和氨基末端切下氨基酸，前者称羧肽酶，后者称氨肽酶。内切酶是另一类肽酶，用于切断蛋白质分子内部肽键使之变成小分子多肽，如嗜热菌蛋白酶。 第7页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四酯酶催化酯键水解，其中羧酸酯酶催化羧酸酯水解RCOOR + H2O RCOOH + ROH磷酸酯酶催化磷酸酯键水解 O O ROPOR + H2O RO POH +ROH | | OH OHR=H时，磷酸单酯酶（如：碱性磷酸酯酶）磷酸二酯酶（如：磷脂酶C

4、)第8页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四水解金属酶之中很多都与Zn2+有关。其次：Ca2+、Mg2+，还有少数酶含Mn2+ 由于水解过程不发生电子转移，所以金属离子的氧化态在催化过程中不变化。第9页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四二、水解金属酶研究中的过渡金属离子EPR、Mssbauer、d-d电子光谱金属酶存在某种过渡金属。Zn2+,Ca2+,Mg2+等离子不具有未充满的d轨道，因此含有Zn2+,Ca2+,Mg2+等离子的金属酶就难以应用上述检测技术获得有用信息。为了深入研究金属酶的性质，通常采用探针。一般采用Co2+代替Zn2+，用Mn2+代替M

5、g2+。非过渡金属Tl+作为K+的NMR探针。第10页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四使用探针离子遵循的原则：同晶置换，即探针离子在酶分子中占据原有金属离子所在的同一位置。电子构型、离子半径、配位几何构型。很关键问题：是否能继续保持酶分子的生物活性。金属配位键的强弱对于决定反应的途径也很重要，而这种配位键的强度可随金属不同而变化。第11页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四第12页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四Zn2+的电子结构：d10，在可见区没有吸收。在羧肽酶研究中采用Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Rh3+

6、，Cd2+，Pd2+等离子取代。Co2+取代的羧肽酶A对肽键的水解具有很强的活性。Co2+羧肽酶A的吸收光谱与经典的四面体配位的钴配合物很不同，而且摩尔消光系数很大，这是由于金属处在畸变四面体配位引起的；圆二色谱、磁圆二色谱和低温EPR谱的结果证实这一点。证明锌酶中的Zn2+处于畸变四面体配位状态。第13页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四第14页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四碳酸酐酶研究中，钴酶活性是锌酶活性的50%，而Ni2+，Mn2+，Fe2+酶仅稍具活性，其它惰性。Co2+取代酶大都能在不同程度上保持酶的催化活性。电子结构、离子半径、配位几何

7、构型。Co2+配合物有多种几何构型，高自旋Co(II)配合物优先采取四面体结构。四面体场中，高自旋Co2+的电子组态为e4t23，相当于Zn2+的d10组态的球对称结构。采用Co2+作为探针，就能提供锌酶的金属结合部位结构的有用信息。第15页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四第二节 羧肽酶羧肽酶是催化肽链的C-末端氨基酸残基水解的酶。 第一个被发现的锌酶 第一个被发现的金属酶 动力学、结构、光谱最清楚的水解酶 羧肽酶分类： 金属酶，存在于胰液中，细胞外酶，帮助蛋白质消化，中性或弱碱性显示极大的活性 非金属酶（酵母羧肽酶C），细胞内酶，在酸性条件下具有很大活性。第16页，共4

8、0页，2022年，5月20日，8点55分，星期四一、羧肽酶A1.组成、结构与功能（1）组成：存在哺乳动物胰脏中，相对分子质量34600， Zn2+作为辅基，单一多肽链，约300个氨基酸残基。研究比较多的是牛的羧肽酶A。 羧肽酶原A在胰蛋白酶作用下，一个肽键断裂，释放出大约60个氨基酸残基的N-末端裂解物。在不同条件下，可以产生4种不同羧肽酶A：307; 305; 300;300第17页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四动物体内羧肽酶原A二聚体或三聚体，无活性胰蛋白酶激活60个氨基酸残基-N末端裂解物肽键断裂不同条件下,四种不同的羧肽酶307，305，300，300通常说的羧

9、肽酶A就是羧肽酶A 第18页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四(2)结构：椭球形，羧肽酶A() 大约一半的氨基酸形成-螺旋结构或-折叠结构。第19页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四其余氨基酸无确定模式，相对容易变形，与底物结合相联系的构象变化主要在这些容易变形的部分发生。酶分子中部一狭长的空腔，底物结合位置。底物的C末端沿这条沟槽伸入到酶分子内的活性部位，空腔中还有一定数量的水分子， Zn2+就处于这条空腔的内表面，它是维持羧肽酶A活性所必须的组分。 第20页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四第21页，共40页，2022年，5月20

10、日，8点55分，星期四Zn2+与多肽链的两个组氨酸（69,196）的咪唑基氮原子，以及谷氨酸（72）的羧基氧原子以配位键结合，第22页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四Zn2+第配位为水。Zn2+处于畸变四面体配位状态中。第23页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四3功能：催化蛋白质或多肽的羧基末端肽键的水解反应。除了脯氨酸之外，羧肽酶能不同程度的催化具有各种C-末端氨基酸的肽链水解。底物的C-末端侧链为芳基或分支较大的脂基羧肽酶显示出很强的活性。 NHCHCONHCHCOO- + H2O | | R2 R1 NHCHCOOH + NH2CHCOO- |

11、| R2 R1第24页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四2.肽水解的催化机理（1）活性部位早期的蛋白链化学修饰法已经确定羧肽酶的活性部位。Zn2+除与组氨酸（His-69)、-196，以及Glu-72形成直接参与催化作用的活性部位外，还包括Arg-145，Tyr-248和Glu-270，它们的侧联基团也是直接与底物结合的部位。当上述氨基酸与其他物质作用而被化学修饰时，酶失去活性第25页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四（2）锌-羰基机理 主要特征：底物的C-末端肽键的羰基通过锌的配位作用而极化，极化羰基的碳原子由于亲核反应发生水解作用。第一步：Arg-1

12、45的胍基和底物的带负电荷的C-末端羧基相互吸引。第二步：底物酪氨酸残基的芳基侧链进入酶的非极性口袋形空腔中挤走4H2O。第三步:底物敏感肽键的-NH-基上的氮原子与酶的Tyr-248的-OH以氢键连结。第26页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四第四步：底物肽键上的羰基挤走了水分子而与锌配位，锌使羰基极化以致碳原子容易接受亲核进攻。第五步：底物末端的羰基碳原子通过一个插入的水分子与酶的谷氨酸Glu-270的侧链以氢键连结。但最后这一步不一定发生。羧肽酶与甘氨酰胺结合的过程，必须通过活性中心的重排，特别是酶分子的构象的重大改变才能实现。Arg-145 和 Glu-270移动0

13、.2nm，Arg的位移带动了肽链的扭转，使Tyr-248移动了1.2nm。第27页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四诱导喫合状态：酶分子构象改变，配位键、范德华力、静电吸引力和氢键等作用力，使酶分子与底物在空间和电荷上都很匹配，因而处于喫合状态。羧肽酶与甘氨酰胺结合正是酶的诱导喫合状态的范例。酶分子构象改变和各种相互作用力使底物肽键处于张力状体下，因此，反应活化能大大降低。第28页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四第29页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四酶与底物结合后进一步反应的步骤有两种不同的观点。第一种：Glu-270激活了水分

14、子，提高了水分子的氧的亲核能力，向底物肽健羰基的碳原子进攻，Glu-270羰基质子化，Tyr-248也提供一个质子，肽键断裂，底物分解。第30页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四第二种：第31页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四锌的作用： 在锌-羰基机理中起了使肽键产生张力的作 用，从而促进了底物的水解。由于Zn2+的作用，底物肽键的羰基碳原子的电子云密度降低而呈正电性，因此羰基碳原子更容易接受亲核进攻。底物末端羧基与Arg-145带正电的胍基连结，触发了Tyr-248大幅度位移，酶显示活性。由此可见：酶与底物的诱导喫合是一个互相识别的动态过程。这个过程

15、发生活性中心重排，使底物有可能被酶的功能基包围而发生催化。第32页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四第三节：碳酸酐酶广泛存在动物、植物和某些微生物体内。可逆催化二氧化碳的水合作用，还能催化醛类水合作用和某些脂的水解。碳酸酐酶分含Zn2+酶和不含Zn2+酶。锌酶，红细胞中仅次于血红蛋白。第33页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四一、组成、结构、功能相对分子量约30000，单一肽链，每个分子含一个Zn2+，260个氨基酸残基，脯氨酸含量较高，没有二硫键。通常碳酸酐酶指碳酸酐酶B。椭球形，分子中有一个袋形空腔， Zn2+结合在空腔底部。 Zn2+与His-93

16、，95，117的N原字配位，第四配位可能有水分子或羟基占据畸形四面体结构。第34页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四第35页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四天然碳酸酐酶和脱锌的酶蛋白有相同的三级结构。因此， Zn2+在碳酸酐酶中不是起稳定空间结构的作用，而是活性中心组分。Co2+取代锌，50%活性。大量实验表明， Co2+占据了Zn2+原来结合部位。第36页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四可推测：金属离子的配位环境是畸变四面体构型。第37页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四第38页，共40页，2022年，5月20日，8点55分，星期四碳酸