熊果酸和齐墩果酸对胰脂肪酶活性及构象的影响

1、熊果酸和齐墩果酸对胰脂肪酶活性及构象的影响【摘要】目的研究熊果酸UA和齐墩果酸A对胰脂肪酶LPS活性和构象的影响。方法采用紫外光谱法、荧光光谱法以及圆二色谱法分析UA和A作用后LPS相应图谱的特征。结果UA和A作用后LPS的活性明显降低，紫外吸收光谱发生改变。荧光淬灭结果显示UA作用后，LPS的荧光发生淬灭，且淬灭的机制为静态淬灭和动态淬灭组合的淬灭机制，而A对LPS荧光淬灭主要为静态淬灭；UA和A作用后LPS的圆而色谱图谱发生改变。结论UA和A都可以抑制LPS的活性、影响LPS的构象，且UA对LPS的构象影响及抑制作用更加显著。【关键词】熊果酸齐墩果酸胰脂肪酶紫外光谱荧光光谱圆二色谱脂肪酶(

2、lipase，简称LPS)是一种特殊的酯键水解酶，广泛存在于动物组织、植物种子和微生物体中，它能催化天然底物油脂水解，产生脂肪酸和甘油1。熊果酸(ursliaid,UA)和齐墩果酸(leanliaid,A)为同分异构体,均属于五环三萜类化合物,广泛存在于中草药中,且具有多种生物活性2。A和UA都具有一定的降脂作用，可以有效地降低高脂血症小鼠的血脂3，4，有望开发成新型降脂药。但A和UA降脂作用的强弱的比拟及降脂作用机理尚未见报道。本文采用紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱等方法，研究了UA和A对LPS活性及构象的影响，比拟了UA和A对LPS抑制作用的强弱，为探寻A和UA降脂作用机理，将其开发为一种双

3、成分降脂新药提供理论参考。1仪器与试剂F-4500荧光光谱仪(日立)，TU-1800紫外可见分光光度计北京普析通用仪器公司，JAS-J-810圆二色谱仪(日本JAS公司)。齐墩果酸和熊果酸购自陕西森弗生物技术，胰脂肪酶购自Siga公司；其余试剂均为国产分析纯。2方法2.1UA，A对LPS活性的影响2.1.1UA，A对LPS的抑制作用酶活性测定采用铜皂法5。2.1.2UA，A对LPS的抑制动力学研究在酶的反响体系中分别参加不同浓度的UA和A，改变底物橄榄油的浓度，测定酶促反响的初速度。以Lineeaver-Burk双倒数法作图，并计算抑制速度常数。2.2UA，A对LPS构象的影响2.2.1不同浓

4、度UA、A对LPS的紫外吸收光谱和荧光光谱测定取2l浓度为110-5l/L的LPS溶液，分别参加不同微量体积的UA和A1.010-3l/L溶液，使三萜类小分子与LPS的终摩尔比分别为01，0.21，0.41，0.61，0.81，11，31，51。混合均匀后，室温放置10in，以一样浓度的小分子溶液作空白，记录200300n的紫外吸收光谱。以295n为激发波长，室温下测定300400n的荧光光谱，溶液浓度及反响条件同上述。2.2.2圆二色(D)谱测定样品池光程为0.1,在室温下测定波长范围190250n的D谱。D谱用平均残基摩尔椭圆度表示，单位为deg2l-1，数据经3次扫描取平均值。得出D谱后

5、,用该仪器附带的杨氏方法软件计算脂肪酶的二级构造含量。LPS浓度为110-5l/L，实验时三萜类小分子与LPS的终摩尔比为01，0.41，31。3结果与讨论3.1UA，A对LPS活性的影响不同浓度的UA，A对LPS活力的影响结果见图1。由图1可以看出，UA，A对LPS都有一定的抑制作用，抑制作用随UA，A浓度的升高而增强。在一样浓度下，UA的抑制作用大于A。3.2UA，A对LPS的抑制动力学UA，A对LPS的抑制作用如图2。由图可知随着UA，A浓度的升高，酶的K值保持不变，而Vax那么随UA，A浓度的升高而不断降低。因此UA、A对LPS均属于非竞争性抑制。采用Dixn作图法，以1/V对不同浓度

6、的UA，A作图，可得到UA，A的抑制常数Ki。UA，A的Ki分别为0.6l/L，0.46l/L，可见抑制作用UA大于A。3.3不同浓度UA，A对LPS的紫外吸收差谱大多数蛋白质分子在280n附近有一个吸收峰，是由于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)等芳杂环对光的吸收；同时在220n左右有一个由肽键的=的-跃迁引起的强吸收峰，与蛋白质的-螺旋含量有关7。用不同浓度的UA，A作用于LPS的紫外吸收差谱如图3。可知LPS在270n和220n附近出现最大吸收峰，且随UA、A浓度的增加LPS在220n和270n附近的吸收不断增大，图3A中最大吸收都有少许红移。在低浓度时，酶在220n和270n附近的吸收

7、随浓度的增加而急剧增加，当UA与酶的比例到达1/1后，紫外吸收增幅减慢。因此可以认为UA与LPS的摩尔比例为1/1时，具有最大紫外吸收。图3B中A作用后的LPS最大吸收峰发生红移，当A与酶的比例到达3/1后，紫外吸收增幅明显减慢。因此可以认为A与LPS的摩尔比例为3/1时，具有最大紫外吸收。从由不同浓度的UA、A作用后LPS的紫外吸收差谱可见，LPS270n和280n附近的吸收主要是由于肽键=基的-跃迁所引起，与蛋白质的-螺旋含量有关6。当UA、A浓度较低时，这些小分子与LPS的结合有利于酶分子间和分子内的团聚作用，使包围在LPS分子内部的色氨酸和酪氨酸残基的芳杂环疏水基团裸露出来,改变了芳香

8、族氨基酸残基在空间构造中所处的微环境使蛋白质分子的构象发生改变，螺旋含量减少；当小分子浓度进一步升高时，UA处理后的LPS分子发生蛋白质肽链伸展现象，使酶分子中疏水作用略有增强，吸收峰略增加且略有红移7，因此在紫外差谱中酶的最大吸收增加明显减缓，并产生红移。而A没有红移现象，说明UA与酶的结合对酶构象的影响较A大。转贴于论文联盟.ll.3.4不同浓度UA，A对LPS的荧光光谱的影响蛋白质中芳香氨基酸的荧光特性可用来推测蛋白质的溶液构象，提供有关蛋白质生色基团的构造及所处微观环境的信息。蛋白质分子中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)具有荧光性质，此蛋白质内源荧光可作为探针检测

9、蛋白质构象变化。295n波长光激发时，蛋白质分子中的Trp残基受到激发，所产生荧光的强度和位置与这些残基所处的微环境亲密相关8。由图4可知，295n激发时荧光光谱的最大发射波长是340n，随着UA、A浓度的不断增加，荧光强度明显减弱,出现典型的荧光猝灭现象，说明其与酶结合后引起蛋白质的构象变得疏松，部分构象发生变化，变化后的构造不利于酶的催化，故酶活力逐渐降低9。而在图4A中，随着UA浓度的增加，发射峰位红移，说明LPS中发生荧光淬灭的Trp和Tyr残基周围的疏水性有所增加。同时出现了裂峰，原来341n处的单峰逐渐裂分为二重峰，其中一峰峰值蓝移至325n，另一峰峰值红移至360n。蓝移峰最可能

10、是LPS中Tyr残基受UA诱导而终止与Trp残基间的共振能量转移，分裂出自身的荧光发射峰；红移峰应归属于Trp残基10，11,说明原来疏水环境的Trp残基逐渐暴露在极性环境中，使蛋白质的构象变得疏松，酶催化活力降低10。3.5UA，A对LPS荧光淬灭的机理假设将UA，A对LPS荧光的淬灭归因于分子碰撞引起的动态淬灭,按照Stern-Vler方程12：F0/F1Kq0Q1KsvQ1式中：F0为无淬灭剂时LPS的荧光强度，F为有淬灭剂时LPS的荧光强度，Kq为分子淬灭速率常数，0为淬灭剂不存在时物质的荧光寿命，Ksv为动态淬灭常数，Q为淬灭剂浓度。当温度为20时，求出KsvUA=17.19104(

11、lL)-1图5KsvA=10.62104(lL)-1。生物大分子的荧光平均寿命约为10-8s，因此可以求得KqUA=17.191012(lL)-1s-1。KqA=10.621012(lL)-1s-137时，求出KqUA=17.021012(lL)-1s-1KqA=10.351012(lL)-1s-1。远大于各类淬灭剂对生物大分子的最大扩散常数2.01010(lL)-1s-1，说明UA、A对LPS的荧光淬灭并不是由于分子扩散和动态碰撞引起的动态淬灭，而可能是静态淬灭。但从图5可以看出当Q1.010-5lL-1时，UA的Stern-Vler曲线开场偏向Y轴，说明存在一定的动态淬灭效应。因此当淬灭剂

12、UA浓度较低时以静态淬灭为主,随着淬灭剂浓度增大,动态淬灭逐渐表达。因此，静态淬灭和动态淬灭是导致UA对LPS荧光淬灭的两大原因，而A对LPS荧光淬灭主要归因于静态淬灭。3.6结合常数和结合位点数的计算设UA、A与LPS之间形成n个结合位点的复合物,那么结合常数Ka和n值可从式(2)计算得到13lg(F0-F)/F=lgKA+nlgQ(2)不同温度下求得的KA值和n值列于表1，从表1可以看出，UA、A与LPS之间都只有一个结合位点，具有强的互相作用。随着温度升高,产物的稳定性降低,静态淬灭常数KA减小，进一步推断淬灭过程为形成化合物所引起的静态淬灭。表1不同温度下药物与LPS结合常数KA和结合

13、位点数略3.7不同浓度UA、A作用后LPS的圆二色谱蛋白质的D光谱178250n为远紫外区D光谱,可以反映肽键的圆二色性。在蛋白质或多肽的规那么二级构造中,肽键是高度有规律排列的,排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。因此具有不同二级构造的蛋白质或多肽所产生D谱带的位置、吸收的强弱都不一样14。图6为不同三萜类药物浓度下LPS溶液的D光谱。其中1曲线(LPS空白)显示了典型LPS的构造,分别在206n和220n处出现负峰,在191n处出现正峰,随着药物的参加,LPS的D光谱的负峰强度逐渐降低,且计算得到在UA，A最大浓度作用下螺旋含量分别减少了3.51%和2.86%，说明药物分子与LPS结合后引起其微构像的变化,使LPS肽链伸展,改变了LPS的二级构造,导致螺旋构造的减少14，15。从图6和螺旋含量变化可以得出一样浓度下UA比A对酶二级构造影响更加显著，在紫外光谱和荧光光谱根底上证实了UA对LPS构象的影响比A显著。以上实验结果可以看出，UA和A都可通过非竞争性抑制作用抑制