免疫细胞的分离及检测技术课件

1、第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术免疫细胞所有与免疫相关的细胞都属于免疫细胞.淋巴细胞抗原提呈细胞(APC)其他免疫细胞所有与免疫相关的细胞都属于免疫细胞.免疫细胞的分离及检测技术课件第一节 免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离第一节 免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离 一、外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单

2、个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。 一、外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞（peripher细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.093 Ficoll分离液-聚蔗糖-泛影葡胺溶液2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1份34%泛影葡胺生理盐水溶液，比重为1.077 0.002Ficoll分离液-聚蔗糖-泛影葡胺溶液2份6%聚蔗糖蒸用1.0770.00

3、1的分层液可将细胞分离 用1.0770.001的分层液可将细胞分离 免疫细胞的分离及检测技术课件二 、淋巴细胞分离贴壁粘附法 吸附柱过滤法 磁铁吸引法 Percoll 分离液法 （连续密度梯度离心）（去单核细胞）二 、淋巴细胞分离贴壁粘附法 （去单核细胞）原理：利用单核细胞具有贴壁生长的特点贴壁粘附法原理：利用单核细胞具有贴壁生长的特点贴壁粘附法原理：利用单核细胞具有贴壁生长的特点吸附柱过滤法原理：利用单核细胞具有贴壁生长的特点吸附柱过滤法原理：利用单核细胞具有吞噬 功能的特点磁铁吸引法 原理：利用单核细胞具有吞噬 功能的特点磁铁吸引法 E花环沉降法 尼龙毛柱分离法 三、T细胞和B细胞的分离E

4、花环沉降法 三、T细胞和B细胞的分离方法：淋巴细胞+SRBC悬液加入分层液T细胞形成E花环而沉于管底悬液中为B细胞。E花环沉降法E花环沉降法方法：淋巴细胞通过聚酰胺纤维管洗脱下来的是T细胞尼龙毛柱分离法方法：淋巴细胞通过聚酰胺纤维管洗脱下来的是T细胞尼龙毛柱四、T细胞亚群的分离 亲和板结合分离法 磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法 四、T细胞亚群的分离 亲和板结合分离法 方法：将所需的细胞对应的单克隆抗体包被于小管内加入淋巴细胞形成Ag-Ab复合物洗去不反应的物质。亲和板结合分离法方法：将所需的细胞对应的单克隆抗体包被于小管内加入淋巴细胞免疫细胞的分离及检测技术课件免疫细胞的分离及检测技

5、术课件磁珠大小可以选择磁珠大小可以选择大小免疫磁珠分离细胞的特点比较 比较项目大磁珠小磁珠对细胞的影响对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养。对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养。对流式细胞仪的影响阻塞流式细胞仪的喷嘴，影响散射光。可直接上流式细胞仪检测，不影响散射光。分离条件要求技术简单，分离可在试管中完成。需要很强的磁场来分离细胞。 收率得率高。得率不高。纯度纯度低。纯度高。分离时间分离速度快。分离速度慢。分离成本成本低。需要很强的磁场来分离细胞，需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行。大小免疫磁珠分离细胞的特点比较 比较项目大磁珠小磁珠对细胞的免疫细胞的分离及检测技术课件

6、免疫磁珠法细胞分选过程免疫磁珠法细胞分选过程免疫磁珠细胞分选装置免全自动细胞分选系统全自动细胞分选系统流式细胞分析仪流式细胞分析仪分离细胞的保存及活力测定分离细胞的保存：两种方式 细胞活力测定：台盼蓝染色 分离细胞的保存及活力测定分离细胞的保存：两种方式 分离细胞的保存 1、短期保存用含有10%20%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI 1640培养液可保存数周。2、长期保存及复苏保存：在保护剂二甲亚砜中于液氮（-196)中保存。其过程是：先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含有10%二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬 液，分装于冻存管内，立即放入降温过渡站

7、( -80)中，继而进行降温(-196)冷冻。 复苏：将其从液氮中取出，立即放入40 温水中，融化后加入10倍的培养液混匀，低速离心，洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力。分离细胞的保存 1、短期保存细胞活力的检测常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞而使细胞着色（蓝色）。细胞活力的检测常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细第二节 淋巴细胞标志及亚群分类 常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。 第二节 淋巴细胞标志及亚群分

8、类 常用于鉴定和检测淋巴细胞细胞表面分化抗原（CD抗原）适用于T、B细胞的分离已知CD抗原细胞亚群的分离未知CD抗原细胞亚群的分离（阴性分选）细胞表面分化抗原（CD抗原）适用于T、B细胞的分离一、T细胞表面标志及其亚群 CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）CD4+CD25+调节性T细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）一、T细胞表面标志及其亚群 CD3+CD4+CD8-辅助性T二、B细胞表面标志 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体

9、，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。 二、B细胞表面标志 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受三、NK细胞表面标志 人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。 三、NK细胞表面标志 人类NK细胞表面标志主要以T细胞及NK细胞T细胞及NK细胞第三节 其他的免疫细胞抗原提呈类细胞表面标志第三节 其他的免疫细胞抗原提呈类细胞

10、表面标志第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用免疫细胞表面标志的检测方法淋巴细胞表面标志检测的临床意义第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用免疫细胞表面标志的检测方一、免疫细胞表面标志的检测抗体致敏细胞花环法 免疫细胞化学法 免疫荧光法 流式细胞分析法 一、免疫细胞表面标志的检测抗体致敏细胞花环法 二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义 淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。 对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。 二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义 淋巴细胞表面标志检测是评临床常见疾病中的T 淋巴细胞的变化 临床常见疾病中的T 淋巴细胞的变化 小 结淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在光学显微镜下的形态基本是一样的，因此要对其进行进一步的分类和观察就不能采用形态学的方法，而要依靠对其表面标志的检测。常用于鉴定和检测计数淋巴细胞的表面标志是CD抗原。小 结淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在光学显微镜下的形进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋巴细胞的功能趋向一致和单一。但目前看来，还很少有只通过一个CD抗原就能将某一类淋巴细胞亚群指示出来的CD抗原，CD抗原指示出来的淋巴细胞亚群多数都是相对特异。进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋巴细胞的功能趋向