医学可见紫外分光光度法课件

1、 可见紫外分光光度法Vis-UV SpectrophotometryChapter 11 可见紫外分光光度法Vis-UV Spectrophoto第一节 物质的吸收光谱第二节 分光光度法基本原理第三节 可见分光光度法第四节 提高测量灵敏度和准 确度的方法第一节 物质的吸收光谱1. 掌握分光光度法基本原理Lambert-Beer 定律，能熟练运用Lambert-Beer公式进行 有关计算。2. 掌握吸光度、透光率、吸光系数、摩尔吸 光系数的概念。3. 熟悉标准曲线法及标准对照法。4. 了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱。5. 了解分光光度计的基本构造；提高测量灵 敏度和准确度的方法。本章教学要求

2、1. 掌握分光光度法基本原理Lambert-Beer本章教 分析方法的分类 按方法的原理：可分为化学分析和仪器分析。 化学分析：凡主要利用化学原理进行分析的方法称为化学分析法； 仪器分析：主要利用物理学原理进行分析的方法则称为仪器分析法。 如：光谱分析法 ，色谱分析法 ，质谱分析（MS）法 ，电化学分析法 ，核磁共振（NMR）分析法等。 光谱分析法：常用的有可见、紫外分光光度法（UV）、红外分光光度法（IR）、荧光光度法、 分析方法的分类 原子吸收法和X射线原子荧光法等。 UV主要用于药物制剂的含量测定。 激光诱导荧光光谱的灵敏度已达10-22克，达到了检测单个分子的水平，可用于癌症的早期诊断

3、。 分光光度法（吸光光度法）： 根据物质的吸收光谱和光的吸收定律，对物质进行定量、定性分析的一种仪器分析方法。 或者说它是基于被测物质的分子对光具有选择吸收的特性而建立的分析方法。原子吸收法和X射线原子荧光法等。 分光光度法（吸光光度 分光光度法的特点： 灵敏度高-10-5 molL-1 10 -6 molL-1 相对误差小-2%5% 应用广泛-医药、卫生、环保、化工等领域。根据测定时所选用的光源 紫外分光光度法可见分光光度法红外分光光度法 分光光度法的特点：根据测定时所选用的光源 紫外分光光第一节 物质的吸收光谱一. 物质对光的选择性吸收二. 物质的吸收光谱第一节 物质的吸收光谱一. 物质对

4、光的选择性吸收二. 物质 = c 光是以电磁波形式传播的光子流。电磁波能量大小与波长和频率有关。 辐射是量子化的，即不连续地、一份一份地发射或吸收，每一份称一个光子。 光子的能量与辐射频率成正比、与波长成反比：E = h =hc一、物质对光的选择性吸收 = c 光是以电磁波形式传播的光子流。电磁波能量单色光: 单一波长的光束复色光: 含有多种波长的光束电磁波谱: 以波长大小顺序排列的电磁波谱图波长 10pm 300pm 200nm 400nm 800nm 500mm 1cm 1m光谱 射线 X射线 紫外光 可见光 红外光 微波 无线电波方法 光谱法 分光光度法 光谱法 核磁共振 可 见 光38

5、0nm 780nm单色光: 单一波长的光束波长 10pm 3能量 E基态E0第一激发态E1第二激发态E2第三激发态E3吸收光谱发射光谱 E = h 当一束光照射到某物质或某溶液时，该物质的分子、原子或离子与光子作用，光子的能量发生转移，物质中的这些粒子就会发生能级跃迁，从较低能量状态（基态）跃迁到较高能量状态（激发态）：这一过程称为物质对光的吸收。能基态E0第一激发态E1第二激发态E2第三激发态E3吸收光谱 由于分子、原子或离子的能级是量子化的，不连续的，只有光子的能量(h)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(E)相等时，才能被吸收。 不同的物质，其内部结构不同，基态和激发态的能量差E不同

6、，选择吸收光子的能量也不同，即吸收的波长(频率)亦不同。亦即不同物质只能选择性地吸收某一波长的光。 由于分子、原子或离子的能级是量子化的，不连续光的互补紫400红660橙600黄560绿530蓝绿500绿蓝450蓝420 光的互补：若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色的光。光的互补紫红橙黄绿蓝绿绿蓝蓝 光的互补：若两种物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现 溶液的颜色：是由于它选择性地吸收了一部分光，而呈现它的补色。 例如：三(邻二氮菲)合铁配合物溶液吸收了

7、 508 nm处的光，而呈现紫红色。 溶液的颜色：是由于它选择性地吸收了一部分光， 将某物质的溶液，用不同波长的单色光作入射光，测定这一溶液吸光度A。每种波长的单色光都有其相对应的吸光度。然后以A为纵坐标，波长为 吸收光谱中与吸收峰相对应的波长称为最大吸收波长， max max=515A480 520 560nm 二、物质的吸收光谱横坐标作图，所得曲线即为该溶液的吸收光谱 。 将某物质的溶液，用不同波长的单色光作入射光， 吸收光谱说明，一种物质对不同波长的光的吸收程度是不同的 如P278 图13-2，是三（邻二氮菲）合铁配合物的吸收光谱。表明一种物质的不同浓度的溶液，吸收光谱的形状基本相同，最

8、大吸收波长也一样 吸收光谱体现了物质的特性： 吸收曲线的形状和max 是定性分析的基础 溶液的浓度愈大吸光度愈大 是定量分析的基础 吸收光谱说明，一种物质对不同波长的光的吸收程第二节 分光光度法基本原理一. 透光率和吸光度二. Lambert- Beer 定律第二节 分光光度法基本原理一. 透光率和吸光度二. Lam一、透光率和吸光度I0 = Ia + It + Ir透射光的强度 It与入射光的强度I0的比值称为透光率I0It 实验中，被测溶液和参比溶液分别置于同样质地和厚度的比色皿中，反射光强度大小近似可相互抵消(以参比溶液校正)，则上式简化为 I0 = Ia + It 透光率愈大，溶液对光

9、的吸收愈少IrIa一、透光率和吸光度I0 = Ia + It + Ir透射光 溶液对光的吸收除与溶液本性有关外，还与入射光波长、溶液浓度、液层厚度及温度等因素有关。 透光率的负对数称为 吸光度 A(absorbance)吸光度愈大，溶液对光的吸收愈多二、Lambert - Beer 定律 溶液对光的吸收除与溶液本性有关外，还与入射光 1760年，Lambert从实验中找到了A与液层厚度的关系式： A = k1b k1为与被测物性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度和温度有关的常数 当入射光波长、溶剂和吸光物质种类、浓度和溶液的温度都一定时，该溶液的吸光度只与液层厚度成正比 1852年，Beer从实验

10、中找到了A与溶液浓度的关系式： A = k2 c k2为与被测物性质、入射光波长、溶剂、液层厚度和温度有关的常数 当入射光波长、溶剂和吸光物质种类、液层厚度和溶液的温度都一定时，该溶液的吸光度只与溶液浓度成正比 1760年，Lambert从实验中找到了A与 合并这两个式子，得到单位b 液层厚度：cmc 物质的量浓度：mol L-1 摩尔吸光系数：L mol-1 cm-1Lambert - Beer Low吸光度 = 吸光系数介质厚度浓度A = a b 若浓度的单位改为质量浓度，则单位b 液层厚度：cm 质量浓度：g L-1a 质量吸光系数：L g-1 cm-1A = b c 合并这两个式子，得

11、到单位b 液层厚度：cmL所以， a 和 的换算关系为： = a MT 和 c（b ）的关系为： T = 10 - bc 解：（1） A = a b 0.22 = a 2 140 10-6 a = 785.7 (L g-1 cm-1) （2） = a M = 785.7 112.4 = 8.83 104 （Lmol-1 cm-1） （3）A = - lgT = 0.22 lgT = -0.22， T = 10-0.22 = 0.60 = 60% 例13-1 Cd2+浓度为140 g L-1 ，双硫腙法显色测定波长为520nm，液层厚度2cm，吸光度为0.22，求a、 和T所以， a 和 的换算

12、关系为： = a MT 例13-2 一有色溶液的浓度为c ，透光率为T 。求浓度为原来的1/2时，透光率为多少？解： T = 10 - bc c T 例13-3 有色溶液的液层厚度增加一倍后，透光率和吸光度的改变为多少？ 解： T = 10 - bc b T A 1/2cT 1/2T2 2A2bA = b c 例13-2 一有色溶液的浓度为c ，透第三节 可见分光光度法一. 分光光度计二. 测定方法第三节 可见分光光度法一. 分光光度计二. 测定方法一、分光光度计一、分光光度计分光光度计四大系统光源系统检测器吸收池分光系统数据处理器分光光度计四大系统光源系统检测器吸收池分光系统数据处理器 1.

13、 光源系统：提供波长范围为3601000nm的连续光谱。可见光光源为钨灯，要求强度高，稳定性好。 2. 分光系统：提供所需波长的单色光。单色器由狭缝、光栅和准直镜组成，要求适当宽度的狭缝，以保证单色光光强和纯度。 3. 吸收池：用来盛放溶液的容器。可见光区用光学玻璃，要求光洁、透明、相互匹配。 4. 检测系统：进行光电转换、信号放大及输出。由光电管、放大器、指示器、数字显示器和打印器等装置构成 1. 光源系统：提供波长范围为3 二、测定方法 可见-紫外分光光度法主要用于定量分析。 （一） 标准曲线法根据 Lambert- Beer Law，以该物质吸收光谱图中的max为入射光，测定被测物质标准

14、品配制的一系列浓度溶液的A。以A为纵坐标，以溶液浓度为横坐标，可得一条通过坐标原点的直线。然后，在相同的实验条件下测定被测液的A，在标准曲线上查出被测液的浓度。c（mg/L）A=550nm 40 80 120 2000.60.40.20.0 二、测定方法 （一） 标准曲 为消除溶剂或其他有色物质对入射光的吸收，消除光在溶液中的散射和比色皿对光的反射等的因素的影响，必须采用空白溶液作对照。 测定时，首先将空白溶液置于光路，调节仪器的“Zero”键，使A=0或T=100%，然后开始测定标准溶液或被测液的A。 1. 溶剂空白除被测物以外，其他溶 剂均为无色时，可用溶剂作空白溶液。 2. 试剂空白显色

15、剂有色时，按显色 条件加入各种试剂和溶剂，只是不含 有被测物的标准品。空白溶液 为消除溶剂或其他有色物质对入射光的吸收，消除 （ 二）标准对照法根据 Lambert- Beer Law，以该物质吸收光谱图中的max为入射光，首先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液cS，测其AS，再将样品溶液推入光路，测其AX，则试样溶液的浓度cX为： 此法适于非经常性的分析工作，准确度不如标准曲线法。 （ 二）标准对照法根据 Lambert- B第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法一、分光光度法的误差二、选择适当的显色剂三、选择合适的测定条件四、共存离子的干扰及其消除五、紫外分光光度法简介本节内容可自学，不作要求作业： P249 111，13第四节 提高测量灵敏度