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文档简介

1、实验三 DNA片段的PCR扩增及电泳检测海南大学海洋学院本科实验教学中心 【实验目的】 通过PCR扩增方法检测pCT74中的绿色荧光蛋白质基因。培养学生的实验设计能力和创新能力【实验原理】聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。 它包括: 变性(Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经2535轮循环就可使DNA扩增达10

2、6 倍。主要试剂ExTaq PCR Mix; 引物对：1mol/L; ddH2O;模板DNAPCR扩增引物：p74GFPs: 5 GGTATCGATTGGAATGCATGGAGGA 3p74GFPa: 5 GCTGAATTCTTGTACAGCTCGTCCATG 3PCR主要操作步骤 标记试管 加入各种试剂、混匀、最后加ExTaq PCR Mix（因为里面含有酶） 设立PCR循环程序，进行扩增标记PCR反应管【实验步骤】1. 在0.2 mL Eppendorff管内调制25L反应体系：反应物体积（L）dd H2O 8.92 ExTaq PCR mix12.5引物1 1.3引物2 1.3模板DNA

3、 1反应管放入PCR仪编辑程序进行扩增2. 按下述程序进行PCR扩增: 1） 94 预变性 4 min； 2） 94 变性 30sec； 3） 56 退火 30 sec； 4） 72 延伸 2 min； 5） 重复步骤24, 30次； 6） 72 延伸 10 min； 7） 16 保存.3. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果1琼脂糖凝胶的配制： 1）、称取0.5g琼脂糖，置于三角瓶中，加入50mL 1TAE缓冲液，瓶口用称量纸封好，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂糖溶解。2）、将梳子放置在制胶槽上，在冷却至60左右的琼脂糖凝胶液加入一小滴Gold View，小心混匀，倒到制胶槽上，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层，不要产生气泡（厚度约为34mm）； 3）、 室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子。 4）、制好胶后将凝胶连

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