基因诊疗和基因治疗专业知识培训培训课件

1、基因诊疗和基因治疗专业知识培训基因诊疗和基因治疗专业知识培训基因诊断 用分子生物学技术对生物体的DNA序列及其产物（RNA和蛋白质）进行定性、定量分析，为疾病诊断提供依据。基因诊断的前提 已明确疾病表型与基因型的关系 2基因诊疗和基因治疗专业知识培训基因诊断基因诊断的前提2基因诊疗和基因治疗专业知识培训 基因诊断包括定性和定量分析DNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。3基因诊疗和基因治疗专业知识培训 基因诊断包括定性和定量分析3基因诊疗和基因治疗专业知识 基因诊断的特点

2、 高特异性 高灵敏性 早期诊断性 应用广泛性4基因诊疗和基因治疗专业知识培训 基因诊断的特点4基因诊疗和基因治疗专业知识培训基因诊断的基本技术流程样品抽提DNARNAcDNAPCR扩增分子杂交反转录合成寡核苷酸引物制备和标记探针杂交信号检测5基因诊疗和基因治疗专业知识培训基因诊断的基本技术流程样品抽提DNARNAcDNAPCR扩增基因诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips） W

3、estern免疫印迹（Western blotting） 免疫组织化学诊断 6基因诊疗和基因治疗专业知识培训基因诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交（Nucleic PCR在基因诊断中的应用RT-PCR荧光定量PCR多重-PCRPCR-ASO（等位基因特异性寡核苷酸探针法）PCR-SSCP（单链构象多态性分析）PCR-RFLP（限制性片段长度多态性分析）7基因诊疗和基因治疗专业知识培训PCR在基因诊断中的应用RT-PCR7基因诊疗和基因治疗专业 多重PCR 多重PCR示意图 A：普通PCR；B：多重PCR8基因诊疗和基因治疗专业知识培训 多重PCR 多重PCR示意图 A：普通PCR；PCR-

4、ASO(等位基因特异性寡核苷酸探针法）N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因ASO1ASO2NHM9基因诊疗和基因治疗专业知识培训PCR-ASO(等位基因特异性寡核苷酸探针法）N：正常基因； 单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism, SSCP） DNA的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。10基因诊疗和基因治疗专业知识培训 单链构象多态性分析（single-strand conPCR-SSCP分析原理示意11基因诊疗和基因

5、治疗专业知识培训PCR-SSCP分析原理示意11基因诊疗和基因治疗专业知识培 限制性片段长度多态性分析 （restriction fragment length polymorphism, RFLP） 由于DNA变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。 可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。12基因诊疗和基因治疗专业知识培训 限制性片段长度多态性分析 （restrictionABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C +DAEcoR 限制性内切酶位点的变化13基因诊疗和基因治疗专业知识培训ABCDEFGDEFBGCA

6、GAATTCCTTAAGEF左侧：正常；右侧突变 序列分析用于基因诊断研究14基因诊疗和基因治疗专业知识培训左侧：正常；右侧突变 序列分析用于基因诊断研究14基因诊疗和生物芯片（biochips）基因芯片（gene chips）蛋白质芯片(protein chip)15基因诊疗和基因治疗专业知识培训生物芯片（biochips）基因芯片（gene chips）基因诊断中常用的分子生物学方法比较 方法 优点与问题 解决方案核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐选择合适的探针 PCR灵敏度、特异性高设计合适的引物 SSCP操作简便、检出率不高选择合适的片段 RFLP结果可靠但限制较多选择合适的限制酶 DNA

7、测序可自动化，但不适宜广泛使用与PCR配合使用生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛使用选择合适的芯片16基因诊疗和基因治疗专业知识培训基因诊断中常用的分子生物学方法比较 方法 优点与问遗传病的基因诊断Gene Diagnosis of Hereditary Diseases17基因诊疗和基因治疗专业知识培训遗传病的基因诊断Gene Diagnosis of He（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因诊断- ASO杂交法2.HBS的限制性内切酶谱分析3.HBS的PCR-RFLP分析 18基因诊疗和基因治疗专业知识培训（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因

8、正常的（N）的ASO探针： 5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 突变的（M）的ASO探针： 5-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-31.镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法19基因诊疗和基因治疗专业知识培训正常的（N）的ASO探针：1.镰状红细胞贫血患者基因诊断A斑点杂交结果 N：正常；M突变镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测N-ASOM-ASO正常 突变 突变纯合子 杂合子 纯合子20基因诊疗和基因治疗专业知识培训斑点杂交结果 N：正常；M突变镰状红细胞贫血患者ASO杂交法53正常基因1.15kb(CCT GAG G)53突变基因1.35kb

9、(CCT GTG G)镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析Mst酶切位点（CCTNAGG）2. HBS的限制性内切酶谱分析目 录21基因诊疗和基因治疗专业知识培训53正常基因1.15kb(CCT GAG G)530.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带者患者镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析目 录22基因诊疗和基因治疗专业知识培训0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带者患者镰状红3. HBS的PCR-RFLP分析 正常人的扩增产物经 Mst 消化可生成54bp和56bp两个片段，而镰状细胞贫血症患者的DNA片段不被酶切，仍为110bp，杂合子可见三条带正常人杂合体患者Mark

10、er23基因诊疗和基因治疗专业知识培训3. HBS的PCR-RFLP分析 正常人的扩增产物经 传染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Diseases24基因诊疗和基因治疗专业知识培训传染病的基因诊断 Gene Diagnosis of 一、病毒性疾病甲型肝炎病毒（HAV） HAV系RNA病毒，利用RT-PCR技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。 乙型肝炎病毒（HBV） 设计保守区序列引物，扩增各型HBV DNA片段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型HBV DNA，以便分型。丙型肝炎病毒（HCV） HCV为正链RNA病毒，先反转录成cDNA，再进

11、行巢式PCR检测HCV。 25基因诊疗和基因治疗专业知识培训 一、病毒性疾病甲型肝炎病毒（HAV）25基因诊疗和基因治疗二、细菌引起的疾病结核分枝杆菌 先设计一对特异性引物，用PCR技术扩增出一383 bp序列，再用探针杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。幽门螺杆菌（HP） 主要采用PCR技术：检测HP染色体DNA特异片段；检测HP尿素酶A基因；用PCR-RFLP鉴别HP菌株。26基因诊疗和基因治疗专业知识培训二、细菌引起的疾病结核分枝杆菌 26基因诊疗和基因治疗专业知肿瘤的基因诊断Gene Diagnosis of Malignant Tumors27基因诊疗和基因治疗专业知识培训肿瘤的基因

12、诊断Gene Diagnosis of Mali一、原癌基因与抑癌基因的检测 二、常见肿瘤的基因诊断 乳腺癌 结肠癌 28基因诊疗和基因治疗专业知识培训一、原癌基因与抑癌基因的检测 28基因诊疗和基因治疗专业知识一、原癌基因与抑癌基因的检测1原癌基因的检测 ras 基因家族由H-ras、K-ras和N-ras组成。最常见的突变是第12、13、59或第61位密码子的点突变。 胰腺癌、结肠癌、肺癌以K-ras突变为主，如第12位密码子突变，由编码甘氨酸的GGT突变为TGT、GTT或GAT，少数突变为GCT。 急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras突

13、变为主。29基因诊疗和基因治疗专业知识培训一、原癌基因与抑癌基因的检测1原癌基因的检测29基因诊疗和 PCR及PCR-SSCP分析：扩增ras 基因第12位密码子点突变部位，再用SSCP技术进行分析，或者直接测序确定患者ras原癌基因的点突变。 核苷酸杂交技术（如ASO）：检测ras基因第12位密码子点突变。2. ras原癌基因突变常用的检测方法30基因诊疗和基因治疗专业知识培训 PCR及PCR-SSCP分析：扩增ras 基因第13抑癌基因p53的检测 p53基因以密码子第175位、第248位、第249位、第273位及 第282位点突变率最高。在结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53

14、基因蛋白。p53的基因诊断方法有 （1）PCR-SSCP分析技术 （2）DNA序列分析 （3）PCR-RFLP分析31基因诊疗和基因治疗专业知识培训3抑癌基因p53的检测 p53基因以密码子第175位、第2基因治疗Gene Therapy32基因诊疗和基因治疗专业知识培训基因治疗Gene Therapy32基因诊疗和基因治疗专业 基因治疗 指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。 33基因诊疗和基因治疗专业知识培训 基因治疗33基因诊疗和基因治疗专业知识培训基因治疗分类体细胞(somatic cell)基因治疗

15、生殖细胞(germline)基因治疗只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代34基因诊疗和基因治疗专业知识培训基因治疗分类体细胞(somatic cell)基因治疗只限于 一、基因治疗的策略35基因诊疗和基因治疗专业知识培训 一、基因治疗的策略35基因诊疗和基因治疗专业知识培训 （一）基因置换（gene replacement） 定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。 目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。 36基因诊疗和基因治疗专

16、业知识培训 （一）基因置换（gene replacement） 转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换。基因同源重组技术又称为基因打靶（gene targeting)基因同源重组技术37基因诊疗和基因治疗专业知识培训转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载（二） 基因添加（gene augmentation） 定义: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。类型:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细

17、胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。38基因诊疗和基因治疗专业知识培训（二） 基因添加（gene augmentation） 定义（三）基因干预（gene interference） 定义： 采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。39基因诊疗和基因治疗专业知识培训（三）基因干预（gene interference）39基定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。（四）自杀

18、基因治疗(Suicide Gene Therapy)40基因诊疗和基因治疗专业知识培训定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒自杀基因的作用机制 41基因诊疗和基因治疗专业知识培训自杀基因的作用机制 41基因诊疗和基因治疗专业知识培训 （五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。 42基因诊疗和基因治疗专业知识培训 （五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强二、基因转移技术 43基因诊疗和基因治疗专业知识培训二、基因转移技术 43基因诊疗和基因治疗专业知识培训基因治疗的两种途径载体目的基因in vivoex viv

19、o靶细胞44基因诊疗和基因治疗专业知识培训基因治疗的两种途径载体目的基因in vivoex vivo靶 基因转移(gene transfer)技术 1.病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移45基因诊疗和基因治疗专业知识培训 基因转移(gene transfer)技术 反转录病毒的结构及生活周期（1）反转录病毒 46基因诊疗和基因治疗专业知识培训反转录病毒的结构及生活周期（1）反转录病毒 46基 反转录病毒载体的特点 1）反转录病毒包膜上糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使反转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。 2)前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中，有利

20、于外源基因在靶细胞中的永久表达。 3) 病毒颗粒以出芽的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。 47基因诊疗和基因治疗专业知识培训 反转录病毒载体的特点 1）反转录病毒包膜上 反转录病毒载体的主要缺点 1）随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险； 2）反转录病毒载体的容量较小，只能容纳7kb以下的外源基因。48基因诊疗和基因治疗专业知识培训 反转录病毒载体的主要缺点 48基因诊疗 （2）腺病毒(adenovirus)载体 腺病毒是双链DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 49基因诊疗和基因治疗

21、专业知识培训 （2）腺病毒(adenovirus)载体49基因诊疗和50基因诊疗和基因治疗专业知识培训50基因诊疗和基因治疗专业知识培训腺病毒的优点基因导入效率高，对人类安全；宿主范围广；基因转导与细胞分裂无关；腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。51基因诊疗和基因治疗专业知识培训腺病毒的优点基因导入效率高，对人类安全；宿主范围广；基因转导 腺病毒载体缺点宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。靶向性差。 不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。52基因诊疗和基因治疗专业知识培训 腺病毒载体缺点宿主的免疫反应导

22、致腺病毒载体表达短暂。靶向（3）腺病毒相关病毒载体 单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。AAV Virus Particles53基因诊疗和基因治疗专业知识培训（3）腺病毒相关病毒载体 AAV Virus Pa腺病毒相关病毒载体（AAV）的特点以潜伏感染为主；病毒基因组与细胞共存；若细胞受刺激，表达应激基因，使AAV病毒复制；产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。54基因诊疗和基因治疗专业知识培训腺病毒相

23、关病毒载体（AAV）的特点以潜伏感染为主；54基因诊 AAV载体的缺陷 AAV载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；感染效率比反转录病毒载体低,在40%-80%的成人中存在过感染;可能会引起免疫排斥。55基因诊疗和基因治疗专业知识培训 AAV载体的缺陷 AAV载体常用基因治疗载体整合致病性感染细胞克隆容量反转录病毒 载体随机整合，效率高可能致病分裂细胞7kb腺病毒载体不整合，可能丢失不致病分裂细胞、非分裂细胞腺相关病毒载体定点整合(19号染色体特定区域)不致病分裂细胞、非分裂细胞5kb7.5kb56基因诊疗和基因治疗专业知识培训常用基因治疗载体整合致病性感染细胞克隆容量反转录病毒

24、 2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术 基本原理: 利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA转移至细胞内，并进行表达。 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。57基因诊疗和基因治疗专业知识培训 2.非病毒载体介导的基因转移系统57基因诊疗和基因治疗专业 脂质体介导的基因转移示意图58基因诊疗和基因治疗专业知识培训 脂质体介导的基因转移示意图58基因诊疗和基因治疗 （2）受体介导转移技术 多聚阳离子与细胞配体偶联，通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，配体暴露于表面。

25、 该复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。59基因诊疗和基因治疗专业知识培训 （2）受体介导转移技术 多聚阳离子与细胞配体偶联受体介导转移技术示意图60基因诊疗和基因治疗专业知识培训受体介导转移技术示意图60基因诊疗和基因治疗专业知识培训基因诊疗和基因治疗专业知识培训培训课件 基因直接注射法的优点排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。 62基因诊疗和基因治疗专业知识培训 基因直接注射法的

26、优点排除病毒载体可能潜在的三、基因干预 （gene interference） 63基因诊疗和基因治疗专业知识培训63基因诊疗和基因治疗专业知识培训（一）反义RNA（antisense RNA） 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种： （1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。 （2）构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。64基因诊疗和基因治疗专业知识培训（一）反义RNA（antisense RNA） 64基因诊疗（二）干扰RNA RNA干扰（RNA interference，RNA

27、i）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的mRNA被降解，从而抑制该基因的表达。65基因诊疗和基因治疗专业知识培训（二）干扰RNA RNA干扰（RNA inteRNA干扰的机制 RNA干扰过程主要有2个步骤： （1）小干扰性RNA（siRNA）（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC)。 该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断 长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基对的短双链

28、RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA，siRNA）66基因诊疗和基因治疗专业知识培训RNA干扰的机制RNA干扰过程主要有2个步骤：（1）小干扰性RNA干扰机制示意图 67基因诊疗和基因治疗专业知识培训RNA干扰机制示意图 67基因诊疗和基因治疗专业知识培训1. 体外化学合成; 2.用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳定地生成。siRNA的产生68基因诊疗和基因治疗专业知识培训1. 体外化学合成; siRNA的产生68基因诊疗和基因治疗四、基因治疗的应用研究 69基因诊疗和基因治疗专业知识培训四、基因治疗的应用研究 69基因诊疗和基因治疗专业知识培训腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏症 珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 血友病和其他血浆蛋白缺乏症