第06章-临床生物化学检验的方法与试剂盒课件

1、第六章 临床生物化学检验的方法与试剂盒 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）右江民族医学院医学检验学院 王太重1第六章 临床全国高等医药院校医学检验专业规划教材右江民族医教学目标与要求掌握: 临床生物化学检验方法的分级、标准物质的分级；临床生物化学检验方法和标准物质之间的关系；临床生物化学检验的方法学评价；量值溯源的概念、内容和措施；试剂盒的性能指标与评价。熟悉: 试剂盒的质量标准；临床生物化学检验方法的选择与性能判断。了解: 临床生物化学检验方法的建立；临床生物化学检验试剂盒的分类和特点；临床生物化学检验试剂盒的制备。2教学目标与要求掌握: 临床生物化学检验方法

2、的分级、标准物质的目录 临床生物化学检验方法与标准物质 1临床生物化学检验方法学评价与性能判断 2临床生物化学检验的试剂盒 3临床生物化学检验的量值溯源 4小结与展望5返回总目录3目录 临床生物化学检验方法与标准物质 1临床生物化学检验第一节临床生物化学检验方法与标准物质 一、检验方法与标准物质的分级 二、常规方法的选择 三、方法的建立4第一节一、检验方法与标准物质的分级 41.决定性方法 （definitive method）指准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法。 (一）方法的分级一、检验方法与标准物质的分级 51.决定性方法 （def

3、initive method）指准2.参考方法 （reference method）指准确度与精密度已经充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差与重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度、特异性及较宽的分析范围。 (一）方法的分级62.参考方法 （reference method）指准确度3.常规方法 （routine method）指性能指标符合临床或其他目的的需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析范围，而且经济实用。 (一）方法的分级73.常规方法 （routine method）指性能指标符 根据国际标准化委员（ISO）的权威解释：具有一种或几种理化性质已经充分确定的

4、特性，用以校准仪器、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质，称为参考物质（reference material，RM）。国内多称为标准物质、标准物、标准品。 (二)标准物质的分级8 根据国际标准化委员（ISO）的权威解释：具有一种或几种理化 参考物质包括校准物质(calibration material，calibrator，校准物)和正确性质控物质(trueness control material)。校准物是指在校准函数中其值被用作自变量的参考物质，用于对测量系统校准或对材料赋值。正确性质控物质在国内多称为质控物、质控品、控制物，是用于评价一种测量系统的测量偏差的参考物质。 (二)标准物

5、质的分级9 参考物质包括校准物质(calibration materi根据ISO，较高级别的参考物质分成以下两级：1一级标准品（原级参考物） 是一种稳定而均一的物质，它的数值已由决定性方法确定，或由高度准确的若干方法确定，所含杂质也已经定量，属于有证参考物质(certified reference material，CRM)，附有证书。(二)标准物质的分级2二级标准品（次级参考物）它的示值必须用一级标准品和参考方法并由训练有素的、能熟练掌握参考方法的操作者确定。在发达国家的二级标准品通常是CRM。10根据ISO，较高级别的参考物质分成以下两级：(二)标准物质国际临床化学与检验医学联合会（IFC

6、C）提出：选择临床常规方法应具有实用性和可靠性两方面的要求。至于某一项具体分析方法所应具有的性能标准，可由临床化学家根据采用这一试验的目的决定。二、常规方法的选择 （一）常规方法的选择原则11国际临床化学与检验医学联合会（IFCC）提出：选择临床常规方1.实用性 一般应具备微量快速，便于急诊；费用低廉；应用安全。 2.可靠性 一般具有较高的精密度和准确度，以及较大的检测范围。精密度即变异系数（CV）一般应小于5%。准确度是指测定值与“真值”的符合程度，一般偏差系数应小于5%。 （一）常规方法的选择原则121.实用性 一般应具备微量快速，便于急诊；费用低廉；应用安1.查阅文献与现场考查 根据方法

7、选择的要求对已发表的各种检测方法进行比较与检验，确定哪些方法有充分的科学根据及真实 的使用价值。有条件时通过实验室之间交流，最好是现场考查。（二）常规方法的选择程序 2.确定候选方法 经初步选定的方法称为候选方法。候选方法确定后，要熟悉该法的原理、性能指标及相应的条件等。131.查阅文献与现场考查 根据方法选择的要求对已发表的各种检三、方法的建立（一）确定性能目标与反应原理（二）选择材料和反应条件14三、方法的建立（一）确定性能目标与反应原理141.确定性能目标 根据建立方法的目的，在建立方法之前，设计可以接受的性能目标，包括不精密度、不准确度、线性范围。方法的性能目标是方法建立的基础，也是判

8、断建立方法是否成功的标准。（一）确定性能目标与反应原理151.确定性能目标 根据建立方法的目的，在建立方法之前，设计2.选择反应原理 临床生物化学检验方法按其传统分类可分为光谱法、层析法、电泳法、酶法、电化学法、分子生物学和免疫化学法等，这些方法的建立首先要根据其技术的原理和被测物质的物理化学性质来确定。其中大部分是紫外可见分光光度法，遵守郎伯比耳定律。（一）确定性能目标与反应原理162.选择反应原理 临床生物化学检验方法按其传统分类可分为光1.材料选择 根据方法的性能目标和反应原理选择材料，选择材料时应该注意纯度和结构，临床生物化学检验所用原料的纯度应在分析纯及其以上等级，用作酶促反应底物的

9、材料应注意其立体异构体，如葡萄糖用作葡萄糖氧化酶的底物时，应选择分析纯-D-葡萄糖。另外还应审核材料供应商的资质和材料的生产合格证。（二）选择材料和反应条件171.材料选择 根据方法的性能目标和反应原理选择材料，选择2.选择反应条件（二）选择材料和反应条件测定波长反应体系的pH反应的温度和时间 试剂组份浓度 182.选择反应条件（二）选择材料和反应条件测定波长18（1）选择合适的测定波长 一般选择产物或底物的最大吸收波长作为测定波长，以可获得最大灵敏度。 图6-1 BCP法测定清蛋白光吸收曲线19（1）选择合适的测定波长 一般选择产物或底物的最大吸收波长作 （2）反应体系的pH 对于酶促反应，

10、反应体系的pH一般应是酶促反应的最适pH，同时应兼顾酶、底物和产物的稳定性。 （3）反应的温度和时间 终点法选择在实时反应吸光度曲线的平坦期；速率法选择在零级反应期。 （4）试剂组份浓度 最适组份浓度为造成最大吸光度变化的最低浓度。20 （2）反应体系的pH一、精密度评价二、准确度评价三、线性评价四、回收试验第二节方法学评价与性能判断21一、精密度评价第二节方法学评价与性能判断21精密度是规定条件下独立测定结果之间的符合程度.精密度的评价采用重复性试验 一、精密度评价（一）目的与判断标准（二）评价前准备和评价步骤（三）统计分析22精密度是规定条件下独立测定结果之间的符合程度.一、精密度评价重复

11、性试验的目的是测定候选方法的随机误差。指标是变异系数CV、标准差，CV越小，精密度越好，反之则差，故称其为不精密度。 一、精密度评价（一）目的与判断标准23重复性试验的目的是测定候选方法的随机误差。一、精密度评价（一全国临床检验操作规程（第三版）给出了美国国会1988年临床实验室修正案（clinical laboratory improvement amendment，CLIA88）推荐的常规化学分析项目的允许误差（EA）（表6-1）一般情况下， EA是CLIA88推荐的可接受性能的1/4，不同的医学决定水平（Xc）有不同的EA1.推荐标准 24全国临床检验操作规程（第三版）给出了美国国会19

12、88年临床实表6-1 CLIA88推荐的允许误差(部分)分析项目决定水平（Xc）可接受性能允许误差（EA）氯(Cl)90 mmol/L5%1.1110 mmol/L5%1.4总胆红素(TBIL)17.1 25mol/L6.841.71342.1 mol/L20%17.1总钙(Ca)1.71 mmol/L0.2490.0622.69 mmol/L0.2490.0623.24 mmol/L0.2490.06225表6-1 CLIA88推荐的允许误差(部分)分析项目决定1.96s EA，可以初步接受，进一步判断见后述的方法性能判断。其依据是95 %的随机误差值为1.96 s 。 2.普通标准261.

13、96s EA，可以初步接受，进一步判断见后述的方法性能1.评价前准备 对于评价对象和评价方案均应熟悉。试验用试剂应是同批次配制，或同一批号的商品试剂盒和参考物，仪器也应处于良好的工作状态。（二）评价前准备和评价步骤271.评价前准备 （二）评价前准备和评价步骤271.评价前准备 试验用样品一般选择2个（亦可更多），一个在参考范围或在医学决定水平附近，另一个为异常值，被测物在疾病时增高者用高值，降低者用低值；试验样品的介质应与临床样品一致，并应妥善保存，应保证在整个试验过程中稳定。先作一个初步的批内精密度测定，如果批内精密度不符合生产厂家规定的质量标准，则联系厂家对仪器进行修理或保养，直到批内精

14、密度符合生产厂家规定的质量标准才能进行下面的试验。（二）评价前准备和评价步骤281.评价前准备 （二）评价前准备和评价步骤28批内精密度计算公式如下（教材式6-1）： CV批内（%）= （二）评价前准备和评价步骤29批内精密度计算公式如下（教材式6-1）：（二）评价前准备和评2.评价步骤 2.评价步骤用2个样品每天测定2批，批间测定间隔不得少于2h，每批测定均作2份，至少共测定20天。每批测定至少做一个质控。（二）评价前准备和评价步骤302.评价步骤 2.评价步骤（二）评价前准备和评价步骤30原始实验数据整理表天数批1批2日平均值结果1结果1均值批1结果1结果2均值批2 1（三）统计分析1.

15、数据整理31原始实验数据整理表天数批1批2日平均值结果1结果1均值批1结中间计算结果表天数批1批2（均值批1-均值批2）2（结果1结果2）2（结果1结果2）21Sums (1) (2) (3)32中间计算结果表天数批1批2（均值批1-均值批2）2（结果1式中 I = 总天数（20） = 第 i天第1批测定的平均值 = 第 i天第2批测定的平均值A批间变异估计值（三）统计分析2. 统计计算 首先计算参数A、B和Sr，然后计算批内、批间、天间和总变异系数。33式中 I = 总天数（20）（三）统计分析2. 统计计算 式中 =第 i天全部测定的平均值=测定总均值 B=天间变异估计值 （三）统计分析式

16、中J = 每天测定的样品数（共2个） =第 I天内样品J的第一次测定结果 =第I天内样品J的第二次测定结果 Sr批内标准差 34式中 =第 i天全部测定的平均值=测定总均值 （三）统计分式中: Srr批间标准差; Sdd天间标准差（三）统计分析CV批内（%）= CV批间（%）= CV天间（%）= CV总（%）= 35式中: Srr批间标准差; Sdd天间标准差（三）统计二、准确度评价（一）目的要求（二）比较前准备和评价步骤（三）统计分析36二、准确度评价（一）目的要求36（一）目的要求 须具备：比较试验方法有更好的精密度。干扰已知。与候选方法使用相同的计量单位。37（一）目的要求 须具备：37

17、1比较前准备 试验者应熟悉所用的仪器、试验方法、比较方法和评价方案。试验样品应收集新鲜的正常和异常的临床样品，应有足够宽的浓度范围，各浓度应有合适的比例。如不能及时测定，样品应妥善保存并应在分析物的稳定期内测定。（二）比较前准备和评价步骤 381比较前准备 （二）比较前准备和评价步骤 382评价步骤 样品数至少为40个，每个样品用2种方法分别作双份测定，因此样品应有足够的量，如临床样品的量太少可将2份含量相近的样品混合。每天测定8个样品，双份测定时第一次按顺序1，27，8，第二次8，72，1，共测试5天。 （二）比较前准备和评价步骤392评价步骤（二）比较前准备和评价步骤39表中代码注释： D

18、Xi=|Xi1Xi2|, DYi=|Yi1Yi2|, DXi =|Xi1Xi2|/ DYi =|Yi1Yi2|/=（Xi1Xi2）/2i=（Yi1Yi2）/2（三）统计分析样品号(i)比较方法（X）试验方法（Y）Xi1Xi2DXiDXiYi1Yi2DYiDYi1401.数据整理见下表40表中代码注释： DYi =|Yi1Yi2|/=（Xi12.离群点的检查超过下列控制限的数据为离群点数据。只有1个离群点数据，可直接剔除后进行统计，如出现2个或以上的离群点，应查找原因后剔除、补做。（三）统计分析412.离群点的检查（三）统计分析41DXi 超过DX控制限：DX控制限=4DYi 超过DY控制限：D

19、X控制限=4 控制限的计算42DXi 超过DX控制限：控制限的计算42 DXi 超过DX控制限： DX控制限=4 DYi 超过DY控制限：D控制限=4 控制限的计算43 DXi 超过DX控制限： 控制限的计算43Eij 超过E控制限：Ei1=Ei2= E控制限 = 4E控制限的计算44Eij 超过E控制限：Ei1=Ei2= E控制限 = 4Eij 超过E控制限： Ei1=Ei2= E控制限 = 4E控制限的计算45Eij 超过E控制限： Ei1=Ei2= E控制限3. 试验方法(Y)与比较方法(X)相关回归分析 r0.975 决定系数r20.95，说明两方法的相关性良好。相关系数r 的计算：4

20、63. 试验方法(Y)与比较方法(X)相关回归分析 r0.回归方程的计算：Y = a + bXa = （b ) （三）统计分析47回归方程的计算：Y = a + bXa = （b三、线性评价（一）目的要求（二）评价前准备（三）线性评价的样品 （四）单项式线性统计分析（五）多项式线性分析48三、线性评价（一）目的要求48线性范围（linear range）指检测信号与被测物浓度呈线性时的被测物浓度范围。测量范围（measuring range，分析范围）指在允许误差极限内所能检测的被测物浓度范围。 三、线性评价49线性范围（linear range）指检测信号与被测物浓度呈常规方法应具有较宽的分

21、析范围，至少应包含95的临床样本，包括临床可能出现的高值。太窄后容易导致系统误差。（一）目的要求50常规方法应具有较宽的分析范围，至少应包含95的临床样本，包评价前必须：熟悉仪器、评价方案和试剂。评价样品的介质应与实际测定的样品相一致，理想的样品是病人的低值或高值样品，这往往不易收集到，亦可用病人的混合样品加入分析物作为高值样品，用正常人样品作为低值样品。低值样品在必要时可作减量处理：如分析物为酶可以加热，小分子化合物可以透析，脂类可用超离心或多价阴离子沉淀。难以收集或处理低值样品时，还可用收集到的高值样品用生理盐水进行系列稀释得到。 （二）评价前准备51评价前必须：（二）评价前准备51线性评

22、价应有至少5个不同浓度可选择低值和高值样品各一个，低值样品为1号，高值样品为5号，二者按体积3：1混匀为2号，等份混匀为3号，1：3混匀为4号，形成系列评价样品。（二）评价前准备52线性评价应有至少5个不同浓度（二）评价前准备52至少5个不同浓度的样品（X），随机排列，每个样品重复测定4次（Y），因此样品应有足够的量，并且分析要求在当天完成。（二）线性评价样品53至少5个不同浓度的样品（X），随机排列，每个样品重复测定4次样品序号X1X2X3X4X5制备浓度97760142220842746测定浓度Y197.5764142520902748测定浓度Y297762142220882748测定浓度

23、Y396.8760142020852741测定浓度Y496.5756141820802735极差D = Y1- Y41.0871013Y1 Y20.52320D1 = (Y1- Y2)/D0.50.250.430.200Y3- Y40.34256D2 = (Y3- Y4)/D0.30.50.290.500.46界限值P0.05 = 0.765, P0.01 = 0.889线性评价的测定数据与离群点检查 （四）单项式线性统计分析1.数据整理与离群点的检查4次重复测定结果由高到低排序，以酶法测定肌酐为例，见表6-6：54样品序号X1X2X3X4X5制备浓度9776014222082. 线性回归分析

24、 b = 1.0002a = 0.00564Y = 0.00564 + 1.0002X （四）单项式线性统计分析552. 线性回归分析 （四）单项式线性统计分析553.组内变异试验计算各组内变异均方差（SS组内）：（四）单项式线性统计分析563.组内变异试验（四）单项式线性统计分析564. 线性失拟误差检查对非线性误差的估计称为线性失拟误差（lack of fit，LOF），其公式为：LOFSS剩 总SS组内其中， ，SS剩即剩余平方和，表示回归后引入的误差估计量。式中的 为回归方程的计算值。 （四）单项式线性统计分析574. 线性失拟误差检查（四）单项式线性统计分析57多项式回归第一步判断非

25、线性多项式拟合数据是否比线性好；第二步是当非线性多项式拟合数据点比线性好时，判断最适非线性模型与线性拟合之间的差值是否小于预先设定的该方法的允许偏差。（五）多项式线性分析58多项式回归（五）多项式线性分析58 表6-8 多项式回归分析的顺序阶别 回归方程 回归自由度(Rdf）一次 Y=b0+b1X 2二次 Y= b0+b1X+b2X2 3三次 Y= b0+b1X+ b2X2+b3X3 459 表6-8 一次多项式模型为直线，这是判断某种方法是否为线性的最适方程。二次多项式模型代表一种抛物线反应曲线，有增加趋势（曲线上升）或减少趋势（曲线下降）两种。三次多项式模型代表一种“S”形反应曲线，在测量

26、范围的两端呈非线性。（五）多项式线性分析60一次多项式模型为直线，这是判断某种方法是否为线性的最适方程。回归系数用bi表示，在二次多项式模型中，b2为非线性系数；在三次多项式模型中，b2和b3为非线性系数。计算每个非线性系数斜率的标准误SEi（可由回归程序算出），然后进行t检验，判断非线性系数是否有统计学意义，即与0之间有无显著性差异。 （五）多项式线性分析61回归系数用bi表示，（五）多项式线性分析61一次多项式模型中的b0和b1两个系数不用分析，因为它们不反映非线性。b2和b3的统计分析计算公式如下： t = bi/SEi式6-10 （五）多项式线性分析62一次多项式模型中的b0和b1两个

27、系数不用分析，因为它们不反映自由度的计算公式为：df=LRRdfL：不同浓度样品数R：每个样品重复检测次数Rdf：回归自由度，即回归模型中各系数的数量（包括b0）（五）多项式线性分析63自由度的计算公式为：（五）多项式线性分析63如果二次多项式模型的非线性系数b2，或三次多项式模型的b2和b3中任一个与0比较，都有显著差异（p0.05），则该组数据存在非线性。要注意这只是统计学上的显著性，只是非线性被检测出来了，而不代表对病人的检测结果有多大影响，还要评价非线性度。（五）多项式线性分析64如果二次多项式模型的非线性系数b2，或三次多项式模型的b2和2非线性度通过计算回归线标准误差（Sy.x），

28、可确定二次多项式或三次多项式的最适模型。Sy.x是统计分析测量结果与模型的差值，因此，Sy.x越小，说明该模型越适合数据组。（五）多项式线性分析652非线性度（五）多项式线性分析65每一个浓度下的线性偏差（DLi）计算如下： DLi=p(Xi)（b0+b1Xi）Xi：从X1到X5，p(Xi)：最适多项式回归模型在Xi处的值，DLi：非线性模型与线性模型在每个浓度点的差值。DLi的计量单位与Xi一致。如果要换算成百分比，则将每个DLi除以该浓度值（已知值）或测量均值（相对浓度）再乘以100%。DLi仅表示该浓度水平处的偏差，而不反映点与点之间的偏差。（五）多项式线性分析66每一个浓度下的线性偏差

29、（DLi）计算如下：（五）多项式线性分3随机误差这是检测方法的“可重复性”，用sr来表示（或用比例误差CVr表示）。如果不同浓度样品间的sr大致相等，则其可重复性较恒定（恒定sr ）。如果在高浓度处的差值较大，则可重复性大小可能与浓度值成比例变化，此时应用CVr表达。可重复性大小可用方差分析来计算，以误差均方的平方根表示。（五）多项式线性分析673随机误差（五）多项式线性分析672次重复测定时，可重复性的计算公式如下：L：样品数， ri1和r i2分别为该方法的两次测量结果，或为均值的百分比（但要注意每个浓度处的单位要统一）。（五）多项式线性分析682次重复测定时，可重复性的计算公式如下：L：

30、样品数， ri1如果重复测量次数超过2次，则随机误差要用方差分析来计算，公式如下： R：为重复测定的次数（j=1,2,3R）L：样品数ri：样品i的平均值（五）多项式线性分析69如果重复测量次数超过2次，则随机误差要用方差分析来计算，公式将sr与重复性的设定目标进行比较（浓度单位或百分比单位）。如果sr超过设定目标，则可能是精密度太低，不足以用来真实、可靠地评价线性关系。这时应检查仪器或操作过程，找到引起不精密度低的原因，纠正后重新进行试验。如果方法性能与以前评估重复性时一致，重复测量次数增多一倍，这样可以将均值的标准误降低约40%。（五）多项式线性分析70将sr与重复性的设定目标进行比较（浓

31、度单位或百分比单位）。（四、回收试验分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。目的是测定比例系统误差，以衡量候选方法的准确度。71四、回收试验711.方法将被分析的纯品标准液加入样品中，成为分析样品，原样品加入同量的无分析物的溶液作基础样品，然后用试验方法分析，两者测定结果的差值为回收量。四、回收试验721.方法将被分析的纯品标准液加入样品中，成为分析样品，原样2. 回收率计算 回收率为回收量除以分析样品中纯分析物的浓度，公式如下： Tt：分析样品的测定结果 Tb：基础样品的测定结果Tt Tb：回收量C：分析样品中加入的纯分析物的浓度（加入后浓度）四、回收试验732. 回收率计算 回

32、收率为回收量除以分析样品中纯分析物的浓度式6-14C0：加入的纯分析物的浓度V0：加入的纯分析物的体积TV：总体积四、回收试验74四、回收试验74理想的回收率为100%，如某法测血钙的回收率为95.7%，有4.3%的比例误差，表明一个含钙真值为2.5mmol/L的样品，若用该方法测定，约为2.39mmol/L(2.595.7% )，误差为0.11mmol/L(2.54.3%)。四、回收试验75理想的回收率为100%，四、回收试验753. 注意事项 准确吸量，因为被分析物的理论值是根据加入标准液体积及原样品的体积计算所得，吸量稍有不准，就会影响结果； 样品中加入标准液后，总的浓度必须在方法的分析

33、范围内，一般须加入高、中、低不同浓度做回收试验，计算平均回收率； 加入标准液后，最好使试验样品的被测浓度达到医学决定水平； 加入标准液的体积一般在10%以内。若稀释过大，误差将发生改变，甚至消失。四、回收试验763. 注意事项四、回收试验76五、干扰试验1目的要求 判断评价方法给出的结果是否受非分析物影响及影响程度，即测定方法的恒定系统误差。77五、干扰试验1目的要求 77干扰是指在测定某分析物时，受另一非分析物影响而导致测定结果增高（正干扰）或降低（负干扰）。干扰物质可分为内源性（样品中存在的）和外源性（外界污染的）两类。五、干扰试验78干扰是指在测定某分析物时，受另一非分析物影响而导致测定

34、结果干扰的机理，可有物理作用、化学作用（不产生测定信号，但它增大或减小测定值）以及非特异反应（产生测定信号）等。干扰一般产生恒定系统误差，但如果干扰物随病理生理因素影响，将引起随机误差。 五、干扰试验79干扰的机理，可有物理作用、化学作用（不产生测定信号，但它增 应做的主要干扰物为病人样品中常常出现的黄疸、脂血和溶血；某些药物如维生素C等；实验常用的抗凝剂、防腐剂和稳定剂。质量保证，不存在系统误差；批内精密度在可接受范围内；应不存在前后结果的交叉污染；试验过程有质控监督。五、干扰试验2试验前准备 80 应做的主要干扰物为病人样品中常常出现的黄疸、脂血和溶血；(1)“配对差异”试验即将不同浓度的

35、干扰物加入到试验样品中，然后分别测定加与不加干扰物的样品，比较二者有无偏差，并了解干扰物浓度与偏差程度的关系。 五、干扰试验3干扰试验方法81(1)“配对差异”试验五、干扰试验3干扰试验方法81： (2) 用病人样品作偏差分析 本分析用来证实某类病人样品中是否存在未知的干扰物；进一步肯定加入干扰物试验的结论。 选择2组病人样品，一组含疑似干扰物为测定组，另一组不含疑似干扰物作为对照组，两组的分析物浓度范围应大致相同，每组样品需2040个。 五、干扰试验82： (2) 用病人样品作偏差分析五、干扰试验82 两组样品分别用试验方法和比较方法（参考方法）双份测定，并在2小时内完成。 分别比较每组样品

36、，两种方法间的差异，如测定组有差异，对照组无差异说明存在干扰，如两组均无显著差异说明不存在干扰。 五、干扰试验83 两组样品分别用试验方法和比较方法（参考方法）双份测定，并这两种干扰试验各有优缺点：第一种方法的不足之处是试验样品的介质可能与病理样品的介质不一致，病理样品中的干扰物可能不是原来的药物而是代谢产物，加入的干扰物可能与病理样品中的干扰物不完全相同等。第二种方法的不足之处是：病人通常用多种药物，难以确定干扰物；不是每种测定项目均有参考方法，而且有的参考方法难以在临床实验室中开展；参考方法亦可能受某些物质的干扰。两种方法同时使用，会起互补作用。五、干扰试验84这两种干扰试验各有优缺点：五

37、、干扰试验84试验材料应选择混合血清1份，分成2份，1 份加入干扰物，含量为临床样品中可能出现的最高含量，另一份不加，按比例混合成5个不同干扰物浓度（见线性评价）。每份样品重复测定n次。4试验步骤五、干扰试验85试验材料应选择混合血清1份，分成2份，1 份加入干扰物，含干扰值= 各组均值 未加干扰物相应组的均值。与对照组的（该测定物浓度1.96 s）相比较，可得出某浓度内有无干扰。五、干扰试验5干扰试验统计评价86干扰值= 各组均值 未加干扰物相应组的均值。五、干扰试（一）方法学性能标准（二）单值判断指标（三）可信区间判断指标六、临床生物化学方法学性能判断87（一）方法学性能标准六、临床生物化

38、学方法学性能判断87 性能标准（performance standards, PS）也称分析目标, 应根据不同的应用目的（筛选、诊断、预后、监测）而异。由允许分析误差（allowable analytical error，EA）和医学决定水平（medical decision level，MDL）这两项内容决定： 允许分析误差EA：95样品的允许误差限度； 医学决定水平：用Xc表示，是临床判断结果具有临床意义的被分析物浓度。六、临床生物化学方法学性能判断（一）方法学性能标准88 性能标准（performance standardEA和Xc这两项内容，就是一个测定方法的性能指标。对于每一医学决定

39、水平都应使用在一定Xc值下的EA值。以血清葡萄糖测定为例：在Xc12.8mmol/L， Xc26.7mmol/L，Xc38.9mmol/L时，其相应的EA均为 0.56mmol/L 而在Xc416.8mmol/L，相应的EA 为 1.4 mmol/L（一）方法学性能标准89EA和Xc这两项内容，就是一个测定方法的性能指标。（一）方法误差类别判断指标备注随机误差(RE)1.96STMEASTM=重复试验的标准差比例误差(PE)（R-100）(Xc/100) EAR=平均回收率恒定误差(CE)（偏差）EA由干扰试验测出系统误差(SE)|(a+bXc）-XcEA对比试验回归方程总误差(TERE+SE

40、)1.96STM+(a+bXc）-XcTEA包括随机和系统误差（二）单值判断指标90误差类别判断指标备注随机误差(RE)1.96STMEAST 95可信区间、可信上限及可信下限 统计学表明，测定结果的可靠性与测定次数有关，次数愈多，结果反映真实性愈强。但实际上，不可能进行大量的测定。在统计学中为了估量分析误差的不确定性，对于每一误差可计算其可信区间，用可信上限与可信下限代替单值的估量，EU为误差的可信上限，EL为误差的可信下限。Westgard推荐95%的可信区间， EU是误差单侧的95上限， EL是误差单侧的95下限，用此判断候选方法的可接受性比较可靠。 （三）可信区间判断指标91 95可信

41、区间、可信上限及可信下限 （三）可信区间判断指假如EUEA，但ELEA，说明仅有的数据不足以做出任何有关可接受性的结论，还需继续试验以收集更多的数据，以便对分析误差做出较好的估量。（三）可信区间判断指标图6-2 回归直线的可信区间92假如EUEA，但ELEA，说明仅有的数据不足以做出任何有W是回归线可信区间的宽度（与给定的Xc相对应的Yc值范围），对于一给定的Xc，Yc的上下可信限由方程（abXc）W计算得到。W计算式如下：（三）可信区间判断指标返回章目录93W是回归线可信区间的宽度（与给定的Xc相对应的Yc值范围），第三节 临床生物化学检验的试剂盒一、试剂盒的分类和特点二、试剂盒的质量标准三

42、、试剂盒的制备四、试剂盒的性能指标与评价94第三节 临床生物化学检验的试剂盒一、试剂盒的分类和特用于检验项目测定的含有使用说明书的所有配套试剂的组合，称为试剂盒（reagent kit，kit）。根据方法学的不同，临床生化试剂盒可以分为化学法、酶法、免疫法。根据其物理性状，可以分为固体试剂和液体试剂。根据其组合方法，分为单一试剂和双试剂。正在发展的试剂盒的形式还有快速反应试剂、卡式试剂、多项同测组合试剂和浓缩试剂。一、试剂盒的分类和特点95用于检验项目测定的含有使用说明书的所有配套试剂的组合，称为试固体试剂包括冻干试剂、粉状试剂、干片试剂等形式 。固体试剂的优点是运输方便、保存期长，其缺点是组

43、份均一性较差，瓶间差较大，分装过程中的称量误差和复溶时加入水量的误差都导致瓶间的不均一性，水质的优劣对试剂的稳定性和测定结果的可靠性有相当大的影响。（一）固体试剂和液体试剂96固体试剂包括冻干试剂、粉状试剂、干片试剂等形式 。（一）固体液体试剂是当前的主要试剂形式，其稳定性高，组份高度均一，瓶间差小，测定重复性好，使用方便。液体试剂无需加入任何辅助试剂及蒸馏水，避免了外源性水质对试剂的影响，性能较稳定，测定结果较为准确。缺点是液体型试剂（尤其是酶试剂）保存时间较短，不便于运输。（一）固体试剂和液体试剂97液体试剂是当前的主要试剂形式，其稳定性高，组份高度均一，瓶间试剂盒在使用时，除标准品外，只

44、有一个试剂的，称为单一试剂，如果有两个试剂，则称为双试剂。单一试剂的优点是操作简单，其缺点是稳定性较差，抗干扰能力差。双试剂是目前的主要试剂形式，提高了抗干扰能力、试剂的稳定性和均一性。 （二）单一试剂和双试剂98试剂盒在使用时，除标准品外，只有一个试剂的，称为单一试剂，如1. 提高了抗干扰反应的能力在测定过程中，首先让试剂与样品中的干扰物质反应，反应5分钟后，再用试剂启动真正的测试反应，从而使测定结果更加准确。（三）液体双试剂盒的特点991. 提高了抗干扰反应的能力（三）液体双试剂盒的特点992. 稳定性能优良用户可根据每次样品量多少按一定比例配制适量工作液，当天配制当天用完，这样便可减少试

45、剂损失。如果用户使用的自动生化分析仪有双试剂测定功能，那么，就不必把双试剂混合成工作试剂进行测定，保证了试剂的稳定性。（三）液体双试剂盒的特点1002. 稳定性能优良（三）液体双试剂盒的特点100全液体型生化试剂，在使用过程无需任何辅助试剂及蒸馏水，这就保证避免了外源水质而引起的对试剂的影响，保证了试剂在有效期内的稳定和测定结果的可靠。（三）液体双试剂盒的特点3. 试剂组分高度均一液体型的生化试剂从生产到使用全是液态，这就保证了每一个组分相对均匀，提高了测定的重复性。101全液体型生化试剂，在使用过程无需任何辅助试剂及蒸馏水，这就保1999年发布的WS/T 124-1999临床化学体外诊断试剂

46、盒质量检验和卫生部颁发的临床检验体外诊断试剂质量检定暂行标准(卫药发 (1992)第1号、卫药政发（1994）第444号、卫药政发（1997）第115号)。质量标准包括外观、说明书、包装/标志/运输和贮存、分析性能。二、试剂盒的质量标准1021999年发布的WS/T 124-1999临床化学体外诊断干粉试剂应为白色粉未。液体试剂溶液的外观应澄清、无异物。冻干品或干粉试剂经复溶后，其溶液应澄清、无异物。（一）外观 （二）说明书 名称 用途 测定原理 包装盒内容物 适用仪器 样品要求 测定步骤 结果计算方法 注意事项 贮存条件、有效期、参考范围、主要参考文献，以及生产单位名称、地址、咨询电话及传真

47、号。103干粉试剂应为白色粉未。液体试剂溶液的外观应澄清、无异物。冻干1. 包装 试剂应装在耐酸耐碱的塑料瓶或硬质中性玻璃内。应密封无漏液。试剂盒应有完整的外包装盒。2. 标志 外包装应标明：产品名称；产品可供测定次数或/和装量；产品批号、有效期、贮存条件；产品的批准文号；生产单位名称和地址。3. 每个试剂瓶应有标签，其标志比外包装上的略少。（三）试剂盒的包装、标志、运输及保存1041. 包装 试剂应装在耐酸耐碱的塑料瓶或硬质中性玻璃内。应4. 运输 应在规定的温度下进行，避免雨淋，倒置与重压，轻重轻卸。5. 贮存 应按规定的条件保存，在有效期内应完全符合质量标准的要求。（三）试剂盒的包装、标

48、志、运输及保存1054. 运输 应在规定的温度下进行，避免雨淋，倒置与重压，轻 （四）分析性能106 （四）分析性能106临床生化体外诊断试剂生产企业必须通过YY/T-0287质量管理体系认证或GMP（good manufacturing practice，良好作业规范）认证。 三、试剂盒的制备107临床生化体外诊断试剂生产企业必须通过三、试剂盒的制备107审核供应商提供的产品合格证和质量检验报告单，然后依据原料检验操作规程对原料进行检验，依据原料质量标准判断原料的质量是否合格。1. 原料检验 固体原料在300高温下干燥2小时以上，冷却后，用粉碎机粉碎，100目过筛，得到均匀一致的颗粒。纯水在

49、使用前，应作脱气和无菌处理，一般的作法是煮沸30分钟或高压灭菌20分钟，充氮冷却。 2. 原料预处理 108审核供应商提供的产1. 原料检验 固体原料在300高温下干试剂配制的过程应注意投料的顺序:一般原料，如缓冲剂、酸、碱等应最先投入；辅酶和酶制剂，应在液体pH调制到目标 pH后再投入。搅拌应在低温下进行，转速不得大于500转/分。试剂配制好后，应充氮密封低温（48）保存。试剂配制的环境的空气洁净度为10万级（每升空气中0.5微米尘粒数少于10万个）。 3. 试剂配制 109试剂配制的过程应注意投料的顺序: 3. 试剂配制 109根据试剂的装量，将试剂分装到试剂瓶中，然后，充氮、加盖密封、加

50、贴标签。试剂装量的瓶间差不得大于2%。试剂分装的环境的空气洁净度应为10万级。 4. 试剂分装 110根据试剂的装量，将试剂分装到试剂瓶中，然后，充氮、加盖密封、中间品的检验内容外观、装量、标签、有无漏液，分析性能的检验常用验证法，即用待检的组件，替换已经检验合格的试剂盒中的组件，然后按照成品试剂检验操作规程进行检验，如果其准确度，或精密度，或线性范围达到质量标准，则判断待检组件是合格的，否则是不合格的。 5. 中间品检验 111中间品的检验内容 5. 中间品检验 111将试剂盒的各种组件，包括试剂1、试剂2（如有）、标准物（如有）、说明书，集成为试剂盒的过程。成品组装的环境的空气洁净度为30

51、万级。 6. 成品组装 成品检验的内容包括外观标志与标签说明书分析性能 7. 成品检验 112将试剂盒的各种组件，包括试剂1、试剂2（如有）、标准物（如有四、试剂盒的性能指标与评价113四、试剂盒的性能指标与评价113用相对偏差（Bias%）表示测定结果的不准确度（一）准确度 T：样品靶值批内精密度批间精密度（二）精密度114用相对偏差（Bias%）表示测定结果的不准确度（一）准确度 1. 批内精密度（瓶间差）的测定 用同批号20份待检试剂盒分别测定1份已知血清样品（浓度略高于参考范围上限），按式6-1计算测定结果的均值(1)与标准差(s1)。另用上述20份试剂盒中的1份试剂对相同样品连续测定

52、20次，计算测定结果的均值(2)与标准差(s2)： 式6-17 式6-18当s1 10%以上，这一期限为复溶后试剂的稳定期。3不同温度下的保存期 将原包装试剂盒置4、25、37、45保存，以出现说明试剂变质的指标来确定在不同温度下的保存期。（七）稳定性 返回章目录1262复溶后试剂的稳定性 将复溶试剂分别放在4、25保存，第四节 临床生物化学检验的量值溯源一、标准物质的量值溯源二、检测方法的量值溯源三、检测仪器的量值溯源四、共同的考虑五、无法直接量值溯源的措施127第四节 临床生物化学检验的量值溯源一、标准物质的量值溯源12量值：样品或标准物测量值（value）的简称。 溯源性(traceab

53、ility)：指通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值（量值）能够与规定的参考标准，通常是与国家或国际测量标准相联系起来的特性，称为溯源性 量值溯源有关概念128量值：样品或标准物测量值（value）的简称。 量值溯源有关图6-3 量值溯源图129图6-3 量值溯源图129（一）量值溯源与量值传递（二）标准物质的量值溯源途径一、标准物质的量值溯源130（一）量值溯源与量值传递一、标准物质的量值溯源130在实际测量中，使用不同等级的标准物质，按照由低到高，逐渐进行量值的追溯，直到国际单位，这一过程叫做标准物质量值溯源。相反，从国际基本单位用不同等级的标准物质由高到低进

54、行量值传递，最终到实际测量现场的过程，被称为标准物质量值传递。 （一）量值溯源与量值传递131在实际测量中，使用不同等级的标准物质，按照由低到高，逐渐进行1. 有证参考物质 有证参考物质(certified reference material, CRM)是经过权威机构认证的参考物质。 （二）标准物质的量值溯源途径1321. 有证参考物质 （二）标准物质的量值溯源途径1322. 标准物质量值溯源方法购买标准品时，要求厂家提供该标准品的溯源图；按说明书规定的方法，使用和保存，一瓶标准液只能使用一次，避免反复冻融、反复使用，尤其是标准物质稳定性较差的标准液（如尿素、葡萄糖、胆红素、清蛋白等）以及标

55、准液的基质易挥发的标准液（如用无水乙醇配制的胆固醇标准液等）更应注意此点； （二）标准物质的量值溯源途径1332. 标准物质量值溯源方法（二）标准物质的量值溯源途径133定期用标准品校正仪器； 定值质控血清只能用于临床生物化学室内质量控制及室间质量评价，不能用做常规分析的校正品，也不能用于相应物质含量的标化或仪器分析性能准确性的评价。（二）标准物质的量值溯源途径134定期用标准品校正仪器； （二）标准物质的量值溯源途径134理想的溯源链，其终点是SI 单位，溯源至SI单位的前提是必须有决定性方法、参考方法、一级和二级参考物质。 二、检测方法的量值溯源135理想的溯源链，其终点是SI 单位，溯源

56、至SI单位的前提是必检验方法的溯源的方法包括：研究检测方法的分析性能，确定其不准确度、不精密度、线性范围，评价该法所产生的误差是否在允许误差范围内； 与参照方法（计量学等级较高研究的方法）进行比较，确定其相关性。二、检测方法的量值溯源136检验方法的溯源的方法包括：二、检测方法的量值溯源1361.验证的检测系统 经生产厂家充分验证精密度和准确度的检测系统，称验证检测系统。 2.自建检测系统 自己选择仪器、试剂、校准品进行组合，通过连续的比较链与某测定基准联系起来的检测系统称为自建检测系统。三、检测仪器的量值溯源（一）检测系统的量值溯源1371.验证的检测系统 经生产厂家充分验证精密度和准确度的

57、检测自建检测系统的溯源步骤一般为：维护仪器处于良好状态； 进行精密度测定；选择一个用于比较的已验证的检测系统；（一）检测系统的量值溯源138自建检测系统的溯源步骤一般为：（一）检测系统的量值溯源138自建检测系统的溯源步骤一般为：用同一个可溯源的标准品校正待溯源的自建检测系统和已验证的检测系统， 然后用两个检测系统测定同一批患者样品，对内含分析物浓度分布于可报告范围内的样品进行比较试验；两系统结果进行回归试验，斜率接近1，截距要小；若能保持所有样品结果差异在CLIA88 允许误差的1/4内，说明溯源试验成功。（一）检测仪器的量值溯源139自建检测系统的溯源步骤一般为：（一）检测仪器的量值溯源1391. 正确设置试验参数 设置参数应遵守以下原则：反应时间、样品体积、试剂体积、主副波长、反应类型、标准品浓度等应严格按照试剂说明书进行设置；样品体积和试剂体积应根据仪器规定的试剂1、试剂2的最大体积进行调整，但应保持样品体积和试剂体积的比值不变； （二）检测系统的溯源方法1401. 正确设置试验参数 （二）检测系统的溯源方法140说明书中的反应时间（一般为秒），应换算为仪器的读取吸光度的时间单位（一般为点）；主波长应是待分析物的最大吸收波长，当仪器不提供最大吸收波长时，主波长应尽量接近最大吸收波长，副波长应是其吸收光谱曲线的“波谷”对应的波长，或是等吸收点对应的波长