体外单倍体诱导和单倍体育种

1、关于体外单倍体诱导与单倍体育种第1页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四植物单倍体诱导途径:花药培养、花粉培养胚珠或子房培养（未受精）第2页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四植物花药/花粉培养历史Guha和Maheshwari （1964） 曼陀罗花药培养Nitsch 和 Norreel (1973) 烟草花粉培养（游离小孢子培养） Chu（1973）小麦花粉培养 （早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成功。十字花科、麦类、水

2、稻、玉米等。90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相继成功Konzak (1999) 。第3页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四 花药培养:将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。（器官培养） 花粉培养(小孢子培养)：将发育至一定阶段花粉从花药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。（细胞培养） 1. 花药和花粉培养的概念：第4页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四花药和花粉培养：指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行

3、分裂、分化、最终发育成完整植株。该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”。两者的异同点培养目的相同，均获得小孢子植株。花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。第5页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四2. 花药或花粉培养的意义：供体植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株DH（2n）一年内获得纯系2.1 作物育种（1）缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。第6页，共67页，2022年，5月20日，21点13分

4、，星期四例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。（2）提高了目标基因型的选择效率ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBBaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb第7页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株单倍体方法： AAbb出现的概率为1/4。（2）提高了目标基因型的选择效率 单倍体 二倍体AB

5、- - AABBaB- aaBBAb- AAbbab- - aabb供体亲本AaBb花培第8页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四 植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。（3）诱变育种中的作用第9页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四2.2 物种进化研究 可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。 2.3 遗传分析 单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。2.4

6、 构建连锁图谱 双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建2.5 用于遗传转化 能直接表达外源基因，不受显隐性影响。第10页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四单倍体：具有配子体染色体数的孢子体。 单倍体植物3个明显特点： 1、体细胞染色体数减半 2、生长发育弱，体形小 3、雌雄配子严重不育第11页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四3. 花粉孢子体发育途径（雄核发育）第12页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四3.1 花粉发育的阶段花粉离体培养时，雄核发育最适宜的时期一般是第一次有丝分裂或之前。第13页，共67页，

7、2022年，5月20日，21点13分，星期四3.2 雄核发育途径1、A途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞 （1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体 （2）A-G途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体 （3）A-VG途径（E途径） 由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体 （4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株2、B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞边续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株第14页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四第15页，共67页，2022年，5月20

8、日，21点13分，星期四1、雄核发育与P花粉的形成P-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）2、雄核发育与饥饿处理饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。3.3 雄核发育启动机理第16页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四1、胚状体发育途径 小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。2、愈伤组织发育途径 小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。3.4 花粉植株形态发生方式第17页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四胚状体发育途径部分花药通过胚状体途径

9、形成小植株烟草花药培养第18页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四通过胚状体途径再生形成小植株烟草花药培养第19页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四胚状体发育途径a) 球形胚 d) 鱼雷形胚芸苔属小孢子培养第20页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四愈伤组织发育途径部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药水稻花药培养第21页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株水稻花药培养第22页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四4 花药和花粉培养方法第23

10、页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四4.1 花药培养 1、取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。 2、消毒 70酒精擦洗花蕾表面，或70酒精浸泡30-60s后在1次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。 3、培养 固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。第24页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四4.2 花粉培养(一)花粉的分离与纯化 1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)

11、 将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2、挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。3、机械游离 （1）磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；（2）超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。4、小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子第25页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）30%蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）第26页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四(二)花粉

12、培养方式 1、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。 4、看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。5、微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养6、条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。第27页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四看护培养图解第28页，共67页，2022年，5月20日，

13、21点13分，星期四4.3 白化苗现象第29页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四（一）白化苗产生的影响因素及机理1、内因 供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。2、外因 预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。3、机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。（二）白化苗的控制 通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。第30页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四 Case study: 1、Canola (Brassica napus). Dih

14、aploid plants were generated with high oleic and reduced linoleic and -linolenic acids in the seed oil and field tested for stability of the fatty acids and yield. 第31页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四第32页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四Uninucleate microspores in suspension(Brassica napus)第33页，共67页，2022年，5月2

15、0日，21点13分，星期四Early stage embryos (7-10 days)(B. napus)第34页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四Mid-stage Embryos (10-14 days)(B. napus)第35页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四Late stage embryos (21 days) (B. napus)第36页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四Late stage cotyledonary embryos(B. napus)第37页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星

16、期四“Germination”Cotyledonary embryos transferred to lightgrowth conditions with GA3 (B. napus)第38页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四Growth of haploid seedlings on solid culture medium (B. napus)第39页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四Well-developed haploid plantlet ready for transfer to soil, or for chromosome dou

17、bling (B. napus)第40页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四Mature dihaploid plants (B. napus)第41页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四Flow scheme for anther culture of banana2、 banana 第42页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四A Microspores isolated from banana anthers. Bar 14 m. B Development of callus from anthers after 5 month

18、s on induction medium. Bar 2 mm. C Androgenic embryos formed on calli. Bar 4 mm.D Haploid plantlets regenerated from anthers. Bar 3 cmAssani et al. Plant Cell Rep 2003, 21, 511516第43页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四5. 影响雄核发育和花粉花药培养的因素（一）基因型 植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大。 如在水稻中，籼稻花粉培养力远

19、低于糯稻。第44页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四芸苔属植物Brassica napus不同基因型的小孢子产胚率比较Topas 10,000-200,000 1-20Westar 1000-10,000 0.1-1Delta 100-10,000 0.01-1Bounty 10-100 0.001-0.01基因型胚状体数量/106小孢子 成苗率（%）第45页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四（二）供体植株生长条件和生理状态1、植株生长条件 光温等因素均能影响花药培养力。一般处于适宜生长条件（如温室中）较好。但物种间存在差异。2、植株生长时期 一般是

20、开花始期优于开花末期。3、P花粉的频率 不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理提高P花粉的数量 第46页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四（三）花粉发育时期小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。第47页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四四分体: 醋酸洋红染色四分体: Alexanders 染色单核期双核期成熟花粉粒处于不同发育时期的烟草小孢子第48页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四单核晚期液泡第一次有丝分裂后期双核早期双核中期生殖核生殖核营养核第49页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四一般而言，单核期（

21、第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。形成双核后，在合适的条件，主要由营养细胞分裂产生胚状体。 第50页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期发育时期物种减数分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期烟草单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核期玉米第51页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四对不同发育阶段的花药进行培养测试确定最佳小孢子发育时期的形态特征注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的变化而发生变化处于不同发育阶

22、段的烟草花芽 花粉发育时期的确定第52页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四（四）预处理 预处理是小孢子培养成功的前提条件 预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。 预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。 第53页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四1、高低温处理低温预处理：指在接种之前将材料用0以上低温处理一段时间后再接种。应用较多。处理温度一般在1-14，时间从几小时至几十天不等。不同作物所

23、用的预处理温度及时间差异较大。不同的处理温度需要不同的时间。 例子:小麦穗子培养前4预处理几天，花药培养效率显著提高。 十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为4.39个，6-9处理1天，产胚数提高到61.4个，预处理4天后，胚状体产量降为10.47个。预处理方法：第54页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四 高温处理（热击处理）：指花药接种后，先在较高温度下（30-35）培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。 例子:如烟草，32高温；小麦，33高温预处理显著地提高了小孢子胚胎发生能力（Touraev，1996）第55页，共67页，2022年，5月20日，21点13分

24、，星期四2、化学物质处理包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子去分化。 3、其它包括射线、离心、磁场等。 第56页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四（五）培养基 1.基本培养基 主要为N6和MS培养基。在此基础上发展出一些其它的培养基。如H培养基（适于烟草）、C17培养基（适于小麦）、马铃署-培养基（适于马铃署） 第57页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四2.碳源 包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。一般认

25、为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖似乎为最好的碳源。第58页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四3、激素4、氨基酸5、活性碳6、pH 第59页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四（六）培养条件 1、温度 物种间有差异2、光照 3、植板密度 植板密度与花培效率有很大的相关性。5103到2104ml密度均能有效培养。一般来说，足够数量的、但相对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空间，从则有利于胚状体发生。第60页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四（七）花药壁因素 花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。第61页，共67页，2022年，5月20日，21点13分，星期四6. 单倍体植株鉴定和染色体加倍第62页，共6