分子病理学技术讲稿课件

1、临床病理技术 -免疫与分子病理技术首都医科大学临床病理中心 冯骥良 器官病理学 细胞病理学 超微病理学 免疫病理学 分子病理学 远程病理学大 体细 胞超微结构分子基因病理学的进步是病理技术的进步病理学技术包括： 传统病理学技术 和 现代新技术 人体病理学技术 和 实验病理学技术 原理与方法 免疫组织与细胞化学（Immunohistochemistry and immunocytochemistry）： 是在单克隆抗体技术产生后，利用免疫学原理，将抗原抗体反应应用与组织细胞化学而进一步通过级连放大，增加敏感性。最后用辣根过氧化物酶显色。从而定位组织细胞中抗原（蛋白 多肽、酶）等多种基因产物的特异

2、方法。 在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊和鉴别诊断。 基本原理：形成“抗原抗体复合物”。 图1： CK19阳性的BEL-7402细胞 图2：OV-6阳性的HepG2细胞雄激素受体CD3-T细胞雌激素受体（ER） 常用的抗体标记物 ：1酶 为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件：底物是特异性的，且易于显示；酶反应产物稳定，不易扩散；容易获得纯酶分子且较稳定；酶标记抗体后，不影响两者的活性；被检组织中不应存在内源性相同的酶或其底物。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、硷性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。2荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光

3、的物质。常用的有异硫氰酸荧光素（FITC）、四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）。3生物素 其与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。4金属标记物 如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。 三常用免疫组织化学染色方法 （一）直接法将荧光素(免疫荧光法)或酶直接标记在第一抗体上，以检查相应的抗原。直接法具有特异性强的优点，但敏感性差，耗费抗体多。 （三）PAP法与双PAP法： 既过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法(Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗；然后再与结合，形成一个稳定的多角形结构（PA

4、P）。特点： 敏感性较高； 背景染色低（相对）； 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。 （四）ABC法： 既卵白素生物素过氧化物酶复合物法(Avidin Biotin-peroxidase Complex,ABC) 利用卵白素与生物素特有的高度亲和力，先将生物素与酶结合形成生物素化HRP，再以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成一个复合物；同时先将二抗生物素化。 如将卵白素换成链霉亲和素，则为： 法：(StreptAvidin Biotin-peroxidase Complex)将链霉亲和素和生物素先连结起来，则称： 法：labelled StreptAvidin-Biotin用链霉素抗

5、生物素蛋白连结辣根过氧化物酶，则为： 法：(StreptAvidin Peroxidase conjugataed method) 若用碱性磷酸酶标记链霉卵白素则称法。 若分别用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，则称法特点: 敏感性高，（比高倍）； 背景淡，链霉亲和素更好； 方法较简便，时间较短； 应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。 四免疫组织化学染色过程中需注意的有关事项 正确设置免疫组织化学的对照 对照原则：首先对照第一抗体；替代对照要注意相同的原则；阳性结果阴性对照，阴性结果阳性对照；染色清晰，定位准确。 阴性对照：（）空白对照：用置换第一抗体；（）血清替代对照：用同种动物

6、的正常血清代替第一抗体；阳性对照：用已知或已被实验证明为阳性的组织；自身对照：利用组织切片内的各种不同的组织成分作对照。 2假阳性反应： 非特异性反应：边缘现象、皱折和刀痕、出血和坏死等； 内源性过氧化物酶：红细胞、炎细胞、退变坏死细胞和某些腺上皮分泌物，以及某些富含过氧化物酶的组织，如脑、肝等； 抗体的交叉反应：抗体本身含有与人体组织发生交叉反应的成分； 试剂浓度过高或失效。 3假阴性反应： 组织固定不当或固定时间过长； 抗体效价过低或久置失效； 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； DAB或H2O2的浓度不当。 五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断中的应用 （一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学

7、染色的原因：在常规病理活检中,通常有的疑难病例不能明确诊断。形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性淋巴瘤）因而难于识别，给治疗带来困难。 一些转移性肿瘤常常缺乏特有的组织学特征，因而无法确定其原发病灶（如甲状腺癌和前列腺癌）。 通过一些反映细胞增殖和与肿瘤恶性程度有关的标记物协助识别肿瘤的良恶性。 2间叶组织（软组织）及其肿瘤标记物： （）间叶源性肿瘤：波形蛋白（Vimentin）；（）纤维组织源性肿瘤：纤维瘤、肉瘤，恶纤组。 抗胰蛋白酶（1，）； 抗胰糜蛋白酶（，）； 溶菌酶（Lysozyme）。 3肌细胞及肌上皮肿瘤及其标记物：肌瘤、肌肉瘤、肌上皮瘤。 结蛋白（Desmin

8、），最常用，肌细胞分化最早的标记； 肌动蛋白（Actin），属肌丝蛋白，种亚型分别存在于不同的肌细胞、肌上皮细胞 肌球蛋白（Myosin），属肌丝蛋白，分型（慢）和型（快）收缩纤维，存在于心肌、横纹肌及平滑肌中，肌动蛋白和肌球蛋白均出现在肌细胞发育分化中期。 肌红蛋白（Myoglobin），是心肌和横纹肌结合氧的肌红蛋白，存在于分化成熟的横纹肌中。 骨、软骨和脂肪组织肿瘤及其标记物： ，Vimentin阳性； Lysozyme少数阳性。 滑膜及间皮肿瘤及其标记物：双向分化，无特异性标记物。Keratin,EMA;Vimentin,FN,AAT,ACT,Lysozyme等均有可能阳性。 周围神经

9、肿瘤及其标记物： S-100：神经纤维肿瘤，神经鞘肿瘤。 髓性碱性蛋白（Myelin basic protein,MBA）； 髓鞘相关蛋白（MAG）； 层粘连蛋白（Laminin）。 8淋巴造血组织肿瘤及其标记物： ()LCA（Leucocyte Common Antigen，白细胞共同抗原）；()CD19，CD25，CD20标记淋巴细胞；()CD4，CD8，CD3标记淋巴细胞；()、标记组织细胞；()、（Ki-antigen）标记细胞；()CD11，CD14标记单核细胞、粒细胞。 9神经及神经内分泌肿瘤及其标记物： （）胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic pro

10、tein, ）：胶质细胞、室管膜细胞； （）髓鞘碱性蛋白（）：少突胶质细胞；（）神经细胞烯醇化酶（ Neurun specific enolosa,）：神经细胞；（）神经微丝（Neurofilaments,）神经细胞、嗜铬细胞、副节细胞、瘤； （）嗜铬素（Chromogranin ）：神经内分泌肿瘤。（）其它：、Calcitotin、Gastrin、Glucagon、hGH、Insulin 、Serotonin等。 免疫组织化学最突出的优点： 能在原位确定组织及细胞结构的化学成分。 深入-原位分子杂交和免疫电镜。 电子显微镜技术电子显微镜（electron microsocope）简称电镜，是

11、以电子束为照明源，通过电子流对生物样品的透射以及电磁透镜的多级放大后的荧光屏上成像的大型精密仪器。按工作原理和用途的不同可分为透射式电镜（transmission electron microscope, TEM）和扫描式电镜（scanning electron microscope, SEM）二种基本类型。 图 白藜芦醇处理Jurkat细胞超微结构 一透射式电镜 主要用于观察细胞内部的微细结构，由于电子的穿透力较弱，故用于透射电镜观察的标本必须切成50100nm的超薄切片。换句话说，一个细胞要被切成100200个薄片才适于在透射电镜下观察。样品在被超薄切片之前，一般要经过固定、脱水和包埋等处

12、理，在切片之后还要经过染色等处理才能进行观察。 超薄切片术（techniques of ultrathin section）是最基本的电镜样品制备技术，其基本过程同石蜡切片大体相似，包括取材、固定、漂洗、脱水、渗透与聚合、切片和染色等多个环节，但操作过程比石蜡切片更为细致与复杂。为了获得理想的超薄切片，操作者必须认真对待每一步骤，任何环节的疏忽都可能导致制样的失败。 合格的超薄切片样品应该达到以下基本要求：（1）切片的厚度应在50nm左右，不能超过100nm，以获得较高的分辨率和较高的反差；（2）切片应能耐受电子束的强烈照射而不发生破裂、变形；（3）细胞超微结构保持良好，没有明显的物质凝聚和丢

13、失。 电子显微镜技术： 细胞内的细胞器、细胞骨架或大分子水平的变化。 细胞内的病毒颗粒等。 肿瘤鉴别诊断 病毒包涵体 肾炎的分型 二扫描电镜 扫描电子显微镜就是用聚得很细的电子束流照射要检测的样品表面。由于电子束与样品的相互作用产生各种信息然后通过不同的检测器接收相应的信息，经过处理后显示出样品的各种特征。 扫描电镜具有以下特点：能够直接观察样品的表面的结构；样品制备过程简单，不用切成超薄切片；可以从各种角度对样品进行观察；景深大，图像富有立体感；图像的放大范围广，分辨率也比较高；电子束对样品的损伤与污染程度较小；在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其他信号作微区成分分析。扫描电镜：血管破裂

14、扫描电镜：小肠微绒毛第五节 生物芯片技术 生物芯片技术（biochip technology）是将大量具有生物识别功能的分子或生物样品有序地点阵排列在支持物上并与标记的检体分子同时反应或杂交，通过放射自显影、荧光扫描、化学发光或酶标显示可获得大量有用的生物信息的新技术。生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片、以及元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。可对DNA、RNA、多肽、蛋白质、细胞、组织以及其它生物成分进行高效快捷的测试和分析。 一、基因芯片 基因芯片(gene chip) 是指采用原位合成或显微打印方法，将大量DNA探针固化于支持物表面上，产

15、生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况，为基因诊断、药物筛选以及新基因发现提供了有力的手段。 图 基因芯片 二、蛋白芯片 蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光素的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫可描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到检测多种蛋白质及其功能的目的。如抗体芯片可排列

16、数百种单克隆抗体，通过这张芯片，人们在一次实验中就能够比较几百种蛋白的表达变化。对于诊断疾病：如传染病、肿瘤、遗传病等临床工作以及信号传导、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡和神经生物学等基础研究都具有广泛的应用前景 三、组织芯片 织芯片又称组织微列阵（tissue microarray） 是将数十个 数百个乃至上千个小的组织片整齐的排列在一起到载玻片,形成微缩的组织切片。 其特点有:1. 体积小信息含量高.可根据不同需要进行组合和设计;2. 即可用于形态学观察也可用于免役组织化学染色.原位杂交, FISH 等原位组织细胞学观察和研究.3.高效 快速,低消耗,自身内对照和可比性强,节时、省力、少

17、材、高效利用库存蜡块肿瘤标本的新方法。一个蜡块可连续切片200张，以供原位分析肿瘤相关基因DNA及其表达的mRNA和蛋白质，荧光原位分子杂交（FISH），mRNA原位杂交、免疫组化三种方法可同时在一个芯片蜡块的连续组织芯片中应用。因而可提高实验效率，一张组织芯片上可列阵数十至数百个样本。实验条件最大程度上保持一致，有助于减少实验误差，一个组织芯片蜡块可连续切200张片，进行许多分子标记检测。最大限度地利用有限的标本资源，尤其是少见的病例标本，最小破损原有蜡块。可同时检测一种肿瘤不同阶段的基因表达状况。能在一张片上同时看到一个肿瘤组织在原位、转移 、复发中的基因扩增情况。 六 激光显微切割术 显

18、微切割（Laser micro-desection）就是在显微镜下用手工或仪器采样的方法从组织切片或细胞涂片上将所要研究的形态或表型相同的细胞从组织三维构造中分离出来，获得纯的细胞群（pure cell population），以备进一步作分子水平的研究。微切割技术的贡献就是克服了组织的细胞成分非常繁杂这一重大的缺点。 图 激光显微切割仪 一、微切割的方法 1材料来源 组织切片 冰冻切片 培养细胞 细胞涂片二、微切割后的细胞处理 1DNA提取 如果所获细胞数量在105以上，则可用常规的方法提取DNA。2RNA提取3. 蛋白提取三、微切割的应用 1细胞基因突变及微卫星变异的研究 2细胞基因拷贝数

19、的变化和甲基化水平的检测3定量RT-PCR4比较基因组杂交5cDNA微阵列（芯片） 七 原位分子杂交 原位核酸分子杂交（in situ hybridization, ISH）是应用特定标记的已知核酸探针与组织或细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察。由于核酸分子杂交的特异性强、敏感性高、定位精确、定量可能，因此该技术已广泛应用于生物学、医学等各个领域的研究之中。 图 食管癌肿瘤细胞c-fos mRNA原位杂交图片 八 荧光原位分子杂交染色体分析技术 染色体原位分子杂交技术（Chromsome Analysis by Fluoresce

20、nce in situ Hybridization）的发展为研究染色体上DNA的序列提供了一个最直接的方法。 具有经济、安全、快速、稳定，灵敏度高，多色彩FISH可在同一核内显示两种或多种序列，还可对间期核染色体进行研究；应用不同的探针可显示某一物种的全部基因，某一染色体染色片段及单拷贝序列；结合共焦激光显微镜可对间期核及染色体进行三维结构研究， 精确检测杂交信号优点。 组织切片间期染色体荧光原位杂交 3FISH基因定位（FISH mapping）基因定位时，不但需要确定某段靶序列在染色体上的位置，尚需确定两个或两个以上靶序列在线性DNA分子的排列次序和距离，才能绘出基因图。一般用同位素杂交：

21、先确定每一靶序列在中期染色体上的位置，然后根据它们到端粒的距离确定出线形排列次序。而用FISH方法，两种或两种以上的探针能同时与中期染色体杂交，只要根据两种颜色杂交位点的相互位置，就能直接确定次序。但中期染色体是线形DNA分子经过折叠和包装后形成的，若两个靶序列相距很近，例如间距小于1Mbp，受包装过程的影响，它们在线形DNA分子上的排列与在中期染色体上的排列不一定相同，甚至可能完全相反。学者们发现，靶序列之间在间期核的平均相对距离与它们在线形DNA分子上的距离呈正相关。利用间期核FISH分析不但能排除染色体包装的影响，还能提高测距的分辨率。 图 食管癌细胞单条染色体涂染荧光原位分子杂交，用B

22、AC位点探针特异位点定位BAC FISH四、FISH的应用 1基因定位与基因制图（Gene mapping） FISH已经极大地加速了人类基因定位和基因制图的进程。 2基因诊断(Gene diagnosis) 精确、直观、明了 4FISH在肿瘤生物学中的应用（1）肿瘤细胞遗传学（Onco-cytogenetics） （2）基因定位：FISH可用于分离出的癌基因与抑癌基因初步定位（3）病毒基因插入基因组部分的检测：虽然逆转录病毒以激活原癌基因为主，也有象腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白产物与抑癌基因蛋白产物相互作用而诱导细胞转化。但病毒基因特别是DNA病毒多有病毒基因成分插入到人基因组。利用FISH可以检测到病毒整合到人基因组中的情况，对深入研究病毒致癌机理，以及检测、防治均具有重要意义。 （4）基因的扩增与缺失原癌基因的激活与抑癌基因的失活是目前肿瘤研究的热点。已知原癌基因的