生物化学第章酶促反应动力学市公开课获奖课件

1、第9章 酶促反应动力学一、化学动力学基础二、底物浓度对酶反应速率影响三、酶克制作用四、温度对酶反应影响五、pH对酶反应影响六、激活剂对酶反应影响(kinetics of enzyme-catalyzed reaction) 第1页第1页研究酶促反应动力学意义 酶促反应动力学是研究酶促反应速率以及影响此速率各种原因科学。在研究酶结构与功效关系以及酶作用机制时，需要动力学提供试验证据；为发挥酶催化反应高效率，寻找最有利反应条件；为理解酶在代谢中作用和一些药物作用机制等，都需要掌握酶促反应速率规律。 第2页第2页二、底物浓度对酶反应速率影响第3页第3页酶反应速率对底物浓度作图第4页第4页中间复合物学

2、说 为理解释这个现象，Henri和Wurtz提出了酶底物复合物学说。该学说认为，当酶催化反应时，酶首先与底物结合，生成酶底物复合物，然后生成产物，并释放出酶。反应用下式表示： S + E ES P + E 第5页第5页酶底物中间复合物存在证据电子显微镜和X光衍射直接观测到酶与底物复合物。酶与底物结合后光谱发生改变。溶解度或热稳定性在加入底物后发生改变。分离到了酶底物复合物。超离心沉降过程中，可观测到酶和底物共沉降现象。平衡透析时，观测到底物在半透膜两侧浓度不相同(半透膜一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底物浓度高于无酶一侧)。 第6页第6页（1）平衡学说（Henri，Michaelis和Mente

3、n方程） 19Henri和Brown提出了酶催化反应机理 19Michaelis和Menten完善了这个理论，他们认为酶反应第一步是快速可逆平衡，第二步慢，为限速反应。第7页第7页平衡学说推导反应速度方程假设前提 在推导动力学方程时，有几点假设： 第一步快速平衡，第二步慢，即 k3 E，S ES。 酶以E和ES两种状态存在。 第8页第8页依据平衡学说推导速度方程设Vf 为E与S结合速度，Vr 为ES解离速度，则Vfk 1 ( E0ES )( SES ) Vrk 2 ES 平衡时VfVr k 1 ( E0ES )( SES ) k 2 ES又 S ES SESS第9页第9页依据平衡学说推导速度方

4、程 k1 ( E0ES ) S k 2 ES 解出 ES 得 令 ， 则 第10页第10页依据平衡学说推导速度方程 由于V = k 3 ES，代入前式得 由于当所有E都成为ES时，可达最大反应速度，即Vm = k 3 E0 ，因此 这就是米氏方程。 第11页第11页米氏方程 米氏方程是一个双曲线方程，若以S为自变量，V为因变量，能够作出双曲线，与试验测得结果相符。 第12页第12页（2）稳态理论 1925年，Briggs和Haldane提出了稳态（steady state）理论，对米氏方程做了一项很主要修正： 在 反应式中，k3值不小，后一环节不是限速环节。 所谓稳态是指反应进行一段时间后，系

5、统中酶底物复合物浓度由零逐步增长到一定数值，然后保持不变，即处于稳态水平，此时ES解离和分解速率之和等于ES形成速率，第13页第13页依据稳态学说推导速度方程产生ES速率消耗ES速率 稳态时因此第14页第14页依据稳态学说推导速度方程 移项得令 ，代入上式得 将上式中ES解出得 此ES即为稳态时复合物浓度。 第15页第15页依据稳态学说推导速度方程由于酶反应速率与ES成正比，即 因此 又由于当所有酶都与底物结合形成复合物时，反应速率达到最大，即 ，代入上式得 （稳态法）（快速平衡法）第16页第16页两个米氏方程区别 这两个方程区别就在于快速平衡法推导方程中米氏常数是Ks，而稳态法推导米氏方程中

6、米氏常数是Km。 Ks是ES解离平衡常数第17页第17页米氏方程几种特点从米氏方程中能够看出：当S Km时， ，反应速率达到最大，并与底物浓度无关，属零级反应；当S = Km时， ，因此，Km意义是使反应速率达到最大反应速率二分之一时底物浓度。第18页第18页米氏方程曲线第19页第19页米氏常数意义 Km是酶特性性常数，其单位是浓度单位。在一定反应条件下，对于一定底物，Km是定值。 Km能够判断酶天然底物。有些酶能够作用于几种底物，其中Km最小底物是天然底物。 当k3 Km时，V = Vm = k3E0，此时对底物来说是零级反应，对酶来说是一级反应，k3是一级反应速率常数，k3表示当酶被底物饱

7、和时每秒钟每个酶分子转换底物分子数（又称为转换数），这时k3又能够写成 kcat，kcat 越大，阐明酶催化效率越高。 第22页第22页kcat /Km意义 Kcat /Km表示酶催化效率，Kcat /Km越大，催化效率越高。 ，其最大值极限是k1，而k1是酶与底物结合速率常数，此常数受到底物在溶液中扩散速度影响。 第23页第23页作图法求Km和Vm值 （Lineweaver-Burk双倒数作图法） 将米氏方程两边取倒数得 在一系列S下测出相应反应速率v，以 对 作图，可得出Km和Vm值。 第24页第24页米氏方程双倒数图第25页第25页多底物酶促反应动力学 （酶促反应按底物分子数分类）底物数

8、酶分类催化反应酶种类占总酶百分数单底物单向单底物假单底物异构酶裂合酶水解酶A BA B + CA-B + H2O AOH + BH5%12%26%双底物氧化还原酶转移酶AH2 B A + BH2A2+ + B3+ A3+ + B2+A + BX AX + B27%24%三底物连接酶A + B + ATP AB + ADP + Pi A + B + ATP AB + AMP + PPi6%第26页第26页多底物反应按动力学机制分类（序列反应） 底物结合和产物释放有一定顺序：E+A+BEABEPQE+P+Q 产物不能在两种底物都结合之前释放。这类反应又能够分为两种类型。第27页第27页有序反应（o

9、rdered reaction） 其中P是B转变产物，Q是A转变产物。如脱氢酶辅酶NAD(P)+相称于A，NAD(P)H相称于Q。 第28页第28页随机反应（random reaction） 如肌酸激酶催化肌酸与ATP反应生成磷酸肌酸和ADP。第29页第29页乒乓反应（ping pong reaction） 如转氨酶催化转氨反应：氨基酸1 酮酸2 酮酸1 氨基酸2 A B P Q第30页第30页三、酶克制作用 因酶蛋白变性而酶活力丧失称为酶失活作用，而由于某种物质与酶结合使酶活力丧失称为酶克制作用，酶受克制丧失活力时酶蛋白并没有变性。能克制酶活力物质称为酶克制剂（inhibitor）。 研究酶

10、克制作用是研究酶结构和功能、酶催化机制，以及阐明代谢途径基本手段，也可认为医药设计新药物和为新农药研制提供理论依据。第31页第31页克制程度表示办法 （1）相对活力分数（残余活力分数）（2）相对活力百分数（残余活力百分数）（3）克制分数（被克制而失去活力分数）（4）克制百分数第32页第32页克制作用类型1不可逆克制作用（irreversible inhibition） 克制剂与酶活性中心基团以共价键结合，不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理办法清除。2可逆克制作用（reversible inhibition） 克制剂与酶活性中心基团以非共价键结合，能够用透析、超滤、凝胶过滤等物理办法清除而使酶恢复

11、活力。第33页第33页可逆克制作用3种类型 （1）竞争性克制（competitive inhibition） I 和 S 竞争与酶活性中心结合，两者只能结合一个。竞争性克制剂通常是底物类似物，它能够与酶结合，但不能被酶催化发生反应。第34页第34页竞争性克制剂举例第35页第35页可逆克制作用3种类型（2）非竞争性克制（noncompetitive inhibition） I 与 S 能够分别与酶结合，谁先结合都能够，形成 ESI 三元复合物，但 ESI 中 S 不能转变成产物。这类克制剂是与酶活性中心之外某个部位结合。第36页第36页竞争性和非竞争性克制剂克制机理第37页第37页可逆克制作用3

12、种类型（3）反竞争性克制剂（uncompetitive inhibition） I 只与 ES 结合，只有 ES 能分解出产物，ESI 中 S 不能转变成产物。由于 I 存在增进了 E 和S 结合，因此称为反竞争性克制。 ES + I ESI P + E + I第38页第38页可逆克制作用和不可逆克制作用动力学判别 在反应系统中加入一定量克制剂，以及不同量酶，测定反应速率与酶量关系。斜率较小直线是可逆克制剂，不经过原点但斜率与对摄影同是不可逆克制剂。1. control2. irreversible inhibitor3. reversible inhibitor第39页第39页可逆克制作用和

13、不可逆克制作用动力学判别 在反应系统中加入不同量酶及克制剂，作不同克制剂浓度下反应速率对酶量直线。可逆克制剂得到是一组经过原点但斜率不同直线，不可逆克制剂得到是一组不经过原点但斜率与对摄影同平行线。第40页第40页一些主要不可逆克制剂 （1）非专一性不可逆克制剂 有机磷化合物 有机汞、有机砷化合物 重金属盐 烷化试剂 氰化物、硫化物和CO 青霉素（2）专一性不可逆克制剂 Ks型不可逆克制剂 Kcat型不可逆克制剂 第41页第41页有机磷化合物 诸多农药是有机磷化合物，它们能克制一些蛋白酶及酯酶活力，与酶分子活性部位丝氨酸羟基共价结合而使酶失活。这类化合物强烈地克制胆碱酯酶活力，使乙酰胆碱不能水

14、解成乙酸和胆碱，造成乙酰胆碱积累，引起神经中毒症状。因此这类化合物又称为神经毒剂。用解磷定（碘化醛肟甲基吡啶）或氯磷定（氯化醛肟甲基吡啶）能把酶上毒剂夺取下来，使酶恢复活力，达到解毒作用。 第42页第42页有机磷化合物第43页第43页解磷定解毒机理第44页第44页有机汞化合物 有机汞化合物能与酶巯基结合而使酶失活。过量半胱氨酸或还原型谷胱甘肽能解毒。 第45页第45页有机砷化合物 有机砷化合物能与酶巯基结合而使酶失活。BAL（二巯基丙醇）能解毒。 路易斯毒气第46页第46页为了六十一个阶级弟兄第47页第47页重金属盐 Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+在高浓度时能使酶蛋白变性，低浓

15、度时克制一些酶活力。可用金属螯合剂EDTA、半胱氨酸等螯合除去重金属离子。 烷化试剂含有一个活泼卤素离子，能够修饰酶分子中许多基团，如巯基、氨基、羧基、咪唑基及硫醚基等。烷化试剂第48页第48页氰化物、硫化物和CO 氰化物能与细胞色素氧化酶中Fe2+结合，使酶失活不能呼吸。CO与血红蛋白结合制止氧运送。硫化物能与各种含金属酶形成较为稳定络合物，使酶失活。 糖肽转肽酶在细菌细胞壁合成中使肽聚糖链交联。青霉素与糖肽转肽酶丝氨酸羟基结合，使细菌细胞壁不能合成。 青霉素 第49页第49页青霉素抗菌机理第50页第50页Ks型不可逆克制剂 这类克制剂结构与底物类似，并带有高反应性基团，与酶活性部位结合后，

16、修饰活性部位基团使酶失活。主要修饰活性部位，其它部位也也许修饰。 胰蛋白酶人工底物胰蛋白酶Ks型克制剂第51页第51页Kcat型不可逆克制剂 这类克制剂不但结构与底物类似，并且需要经酶催化反应后才产生高反应性基团，比Ks型不可逆克制剂专一性更强。 -卤代-D-丙氨酸 磷酸吡哆醛丙氨酸消旋酶第52页第52页可逆克制剂（底物类似物）合成叶酸组分磺胺药物竞争克制二氢叶酸合成酶活性 蝶呤 对氨基苯甲酸 谷氨酸 叶酸（磺胺药物）第53页第53页可逆克制剂 （过渡态底物类似物） 过渡态底物类似物克制力更强，由于酶对过渡态底物亲和力比对底物亲和力强得多。各种酶催化反应时过渡态底物过渡态底物类似物第54页第5

17、4页可逆克制剂 （过渡态底物类似物）第55页第55页可逆克制剂 （过渡态底物类似物）第56页第56页四、温度对酶反应影响 在较低温度范围内，酶反应速率伴随温度升高而增长，当温度高到一定程度时，酶开始变性失活，反应速率反而下降。因此对于酶反应来说，有一个最适反应温度。普通来说，动物细胞内酶最适反应温度在3540，植物细胞中酶可达4050，也有一些生长在堆肥、温泉中微生物酶最适温度更高，如Taq DNA聚合酶最适温度可高达70。 需要注意是，最适温度值不是酶特性性常数，此值伴随反应时间延长而有所下降。第57页第57页温度对酶反应速率影响第58页第58页五、pH对酶反应影响 酶活力受环境pH影响，存在一个最适反应pH。酶最适反应pH也不是一个特性性常数，而是受到底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度不同而改变。第59页第59页4种酶pH-酶活性曲线胃蛋白酶木瓜蛋白酶胆碱酯酶胰蛋白酶第60页第60页pH影响酶活力原因pH影响酶活力原因有下列几方面： 过酸或过碱使酶变性失活。 pH偏离最适pH不多时，酶分子中及底物分子中各可解离基团解离状态发生了改变，不利于底物与酶结合及催化反应。 由于酶分子可解离基团解离状态发生了改变，造成酶分子构象发生改变，不利于底物与酶结合及催化反应。第61页第61页最适反应pH示意图第62页第62页六、激活剂对酶反