分子发光分析法课件

1、第三章 分子发光分析法 Molecular Luminescence Analysis1第三章 分子发光分析法 Molecular Lumine本章主要内容 第一节 荧光和磷光的产生 第二节 荧光分析方法 第三节 化学发光分析2本章主要内容 第一节 荧光和磷光的产生2 一、生活中的分子发光现象荧光灯荧光棒荧光笔萤火虫第一节 荧光和磷光的产生3 一、生活中的分子发光现象荧光灯荧光棒荧光笔萤火虫第一节 二、分子发光的概念室温下，大多数分子处于基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快回到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象称为分子发光。激发态基 态吸

2、收能量光辐射4 二、分子发光的概念室温下，大多数分子处于基态的最低振动能分子发光可根据分子受激时所吸收能量来源的不同分为以下几类：光致发光: 以光源来激发而发光(荧光灯, 荧光笔)电致发光: 以电能来激发而发光(发光二极管)生物发光: 以生物体释放的能量激发而发光(萤火虫)化学发光: 以化学反应能激发而发光(荧光棒)5分子发光可根据分子受激时所吸收能量来源的不同分为以下几类：5基态分子受到光照激发后，跃迁到激发态，随后放出能量回到基态。如果能量是以光的形式释放，则会发射出荧光或磷光。在光照激发和退激发光的过程中：分子中的价电子（ 、n电子）处于不同的自旋状态，通常用电子自旋状态的多重性来描述。

3、 三、 分子发光的过程（以光致发光为例）（1）分子中电子的能级发生了变化。（2）分子中电子的自旋状态发生了变化。单个电子的两种不同自旋状态6基态分子受到光照激发后，跃迁到激发态，随后放出能量回到基态。1. 分子中电子自旋状态的多重性大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的 ，处于基态单重态(Singlet state)，用 “S0”表示 ；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 。这种跃迁产生的概率大。S0, S1, S2, S3分别代表基态, 第一, 二, 三激发单重态处于单重态的分子，

4、电子自旋方向相反第一激发单重态 S1基态单重态 S0轨道轨道n轨道71. 分子中电子自旋状态的多重性大多数分子含有偶数电子，基态若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单重态激发三重态(Triplet state),净自旋 0。这种跃迁产生的概率小。处于三重态的分子，电子自旋方向相同T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态轨道轨道n轨道基态单重态 S0第一激发三重态 T18若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单重态激 2 激发态分子的去活化处于激发态的分子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态，其中以速度最快，激发态寿命最短的途径占优势。辐射跃迁指以光的形

5、式辐射多余的能量，包括荧光和磷光。无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫、内转换、外转换和系间跨越等。9 2 激发态分子的去活化处于激发态的分子，通常以辐射跃迁方荧光和磷光体系能级图S0S2S1T1吸光1吸光2振动弛豫内转换系间跨越荧光3磷光4振动弛豫V=3V=2V=1V=0振动弛豫V=3V=2V=1V=0hvhv10荧光和磷光体系能级图S0S2S1T1吸光1吸光2振动弛豫 （1）无辐射跃迁去活化过程振动弛豫在同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为10-12s数量级。S0S2S1T1振动弛豫振动弛豫振动弛豫11 （

6、1）无辐射跃迁去活化过程振动弛豫S0S2S1T1振动内转换指相同多重态间的无辐射跃迁。当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。内转换过程在10-1310-11s之间。S1S2T1S0内转换12内转换S1S2T1S0内转换12S2S1T1S0系间跨越指不同多重态间的无辐射跃迁，它涉及受激电子自旋状态的改变，例如，S1T1，使原来两个自旋配对的电子不再配对。一般情况下难以发生，但如果两个电子能级的振动能级有较大的重叠时，则可以通过系间跨越在不同多重态间进行转移。系间跨越13S2S1T1S0系间跨越系间跨越13外转换指激发分子与溶剂分子或其它溶质

7、分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。14外转换14（2） 辐射跃迁去活化过程荧光发射处于激发态的分子放出热能先回到第一激发单重态的最低振动能级，然后在10-910-7s内发射一个光子并返回基态的过程。S2S1T1吸光1吸光2振动弛豫内转换荧光3S015（2） 辐射跃迁去活化过程荧光发射S2S1T1吸光1吸光S0S2S1T1吸光1吸光2振动弛豫内转换系间跨越荧光3磷光4磷光发射某些单重和三重激发态能级有较大重叠的分子，以放热的形式，经系间跨越达到三重激发态，再经振动弛豫到达三重态的最低振动能级，然后在10-410s内跃迁回基态并发射磷光。振动弛

8、豫16S0S2S1T1吸光1吸光2振动弛豫内转换系间跨越荧光荧光和磷光的根本区别是：荧光是由激发单重态最低振动能级至基态的跃迁产生的；磷光是由激发三重态最低振动能级至基态的跃迁产生的。17荧光和磷光的根本区别是：17荧光和磷光测定注意事项：避免荧光猝灭消除猝灭剂 低温 低浓度荧光物质溶液 18荧光和磷光测定注意事项：避免消除猝灭剂 低温 低浓度183 激发光谱和发射光谱 激发光谱固定荧（磷）光的发射波长（一般在最大发射波长处），改变激发光波长，测量荧光强度的变化。以激发波长为横坐标，荧（磷）光强度为纵坐标作图，即可得到荧（磷）光化合物的激发光谱。发射光谱简称荧（磷）光光谱，固定激发光波长和强度

9、，在不同波长下测定所发射的荧（磷）光强度，以波长为横坐标，以荧（磷）光强度为纵坐标，即可得到荧（磷）光光谱。193 激发光谱和发射光谱 激发光谱19萘的激发光谱、荧光和磷光光谱 激发光谱荧光光谱磷光光谱20萘的激发光谱、荧光和磷光光谱 激发光谱荧光光谱磷光光谱20荧光发射光谱与吸收光谱的镜像关系吸光荧光250300350400450蒽的乙醇溶液的吸收光谱（左）和荧光光谱（右）荧光强度S0S1V=0123V=02310001020344102030吸光荧光21荧光发射光谱与吸收光谱的镜像关系吸光荧光25030035荧光发射光谱和它的吸收光谱之间呈镜像对称的原因是：吸收光谱是物质分子由基态（一般处

10、于最低振动能级）激发至第一电子激发态的各振动能级所致，其形状决定于第一电子激发态中各振动能级的分布情况。荧光光谱是激发态分子从第一电子激发态的最低振动能级回到基态的不同振动能级所致，所以荧光光谱的形状决定于基态中各振动能级的分布情况。因为基态中振动能级的分布和第一电子激发态中振动能级的分布情况类似，因此荧光光谱的形状和吸收光谱极为相似。22荧光发射光谱和它的吸收光谱之间呈镜像对称的原因是：22小 结1 分子发光的概念和类型2 荧光和磷光的产生过程3 激发光谱和发射光谱23小 结1 分子发光的概念和类型23思考题1 分子荧光和磷光的产生有何异同？2 如何避免荧光猝灭现象的发生？24思考题1 分子

11、荧光和磷光的产生有何异同？24第二节 荧光分析方法 分子产生荧光必须具备两个条件：分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；（一般来说，分子中必须具有大的共轭键结构） 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。25第二节 荧光分析方法 分子产生荧光必须具备两个条件：25一、物质结构对荧光光谱的影响1 共轭效应分子结构中具有共轭电子的物质，体系中电子的共轭程度越大，则产生的荧光越强，且光谱产生红移。化合物量子产率F ex（nm） em（nm） 苯萘蒽丁省戊省0.110.290.460.600.5220528636539058027832140048064

12、026一、物质结构对荧光光谱的影响1 共轭效应化合物量子产率F 2 刚性平面结构实验发现，多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。272 刚性平面结构27 3 取代基效应芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2 、-NR2等，使荧光增强。因为产生了p- 共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。吸电子基团，如-COOH、-NO、-C=O、卤素等，会减弱甚至会猝灭荧光。28 3 取

13、代基效应芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的二、溶液的荧光强度（一）荧光强度和溶液浓度的关系If=Kc上式中，If为荧光强度，K为常数，c为溶液浓度。这种线性关系只有在极稀的溶液中，即lc0.05时，才成立。进行荧光测定时，和紫外可见吸收光谱一样，应用标准曲线法定量。29二、溶液的荧光强度（一）荧光强度和溶液浓度的关系29（二）影响溶液荧光强度的因素1 溶剂对荧光强度的影响 （1）溶剂极性的影响在有些情况下，当溶剂极性增大时，荧光增强，荧光峰红移。8-巯基喹啉在不同极性溶剂中的荧光发射情况如下溶剂 介电常数荧光发射峰/nm荧光量子产率F四氯化碳 氯 仿 丙 酮 乙 腈2.245.2 21

14、.538.8390398405410 0.0020.0410.0550.06430（二）影响溶液荧光强度的因素1 溶剂对荧光强度的影响 溶剂 （2）形成氢键或电离使荧光发射波长和强度改变。例如VB6在二恶烷中，荧光发射波长335nm在水中（电离），荧光发射波长400nm（电离）（3）溶剂对激发光或荧光有吸收如苯、丙酮、酚等在紫外区有吸收，不能作为溶剂31（2）形成氢键或电离312 温度对荧光强度的影响温度上升使荧光强度下降。主要有如下原因：（1）随着溶液温度的升高，介质粘度降低，分子运动速率也变大，从而使荧光分子与溶剂分子或其它分子的碰撞几率增加，外部能量转换速率变大。因此，荧光量子产率降低。

15、温度降低24-196322 温度对荧光强度的影响温24-19632（2）分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。 当激发态分子接受到额外热能而沿激发位能曲线AC移动至交点C时，有可能转换至基态的位能曲线NC，使激发能转化为基态的振动能，随后通过振动弛豫而丧失振动能量。 能量电子与原子核间的距离33（2）分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可 3 溶液pH值对荧光强度的影响（1）影响分子的电离程度O-pH9，有荧光pH13，无荧光（2）影响金属离子形成的发光螯合物pH=34时，络合比Ga3+:R=1:1

16、，有荧光pH=67时，络合比Ga3+:R=1:2，无荧光34 3 溶液pH值对荧光强度的影响（1）影响分子的电离程度O 4 内滤光作用和自吸收现象溶液中若存在能吸收激发光或荧光物质所发射荧光的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用”。荧光物质的荧光发射光的短波长的一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。吸光荧光250 300 350400 450荧光强度35 4 内滤光作用和自吸收现象吸光荧光250 300三、荧光分析仪36三、荧光分析仪36激发光源 在紫外-可见区范围，通常的光源是氙灯和高压汞灯。

17、样品池 荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状以正方形和长方形为宜。单色器 光栅检测器 由光电管和光电倍增管作检测器，并与激发光成直角。37激发光源37四、荧光分析法的特点和应用 （一）荧光分析法的特点优点1. 灵敏度高荧光分析法的灵敏度比吸光分析法高24个数量级，检测下限在0.10.001gmL1之间。2. 选择性好既可以依据激发光谱，也可以依据发射光谱鉴定某种物质。3. 荧光法提供比较多的物理参数可提供包括激发光谱、发射光谱和三维光谱以及荧光强度、荧光效率、荧光寿命等多种物理参数。4. 试样量少，测定方便38四、荧光分析法的特点和应用 （一）荧光分析法的特点38缺点应用还不够

18、广泛。这是因为：本身能发射荧光的物质相对较少，用加入某种试剂使非荧光物质转化为荧光物质来进行分析，其数量也还不多。此外，荧光分析的灵敏度高，测定时对环境因素较为敏感，干扰因素较多。 39缺点39（二）荧光分析法的应用1. 无机化合物的分析 1) 直接荧光法 主要是金属元素+有机试剂可发射荧光的配合物例如：Al3+ +桑色素桑色素和Al的配合物（可发射荧光）荧光强度一般与待测物浓度成正比。较常用有机试剂进行荧光法测定的元素为铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素等。40（二）荧光分析法的应用1. 无机化合物的分析 40 2)荧光猝灭法 某种金属离子M可以与某种有机物生成可发射荧光的配合物M

19、 + 有机物 M-有机物(可发射荧光)待测定的金属元素X可以取代配合物中的M，生成无荧光的配合物X + M-有机物 X-有机物 (无荧光) + M荧光强度一般与待测物浓度成反比。采用该法测定的元素有氟、硫、氰离子、铁、银、钴、镍、铜、钨、钼、锑、钛等。 41 2)荧光猝灭法 41 3)间接荧光法 间接荧光法常用于某些阴离子如F-、CN-等的分析M-有机物 (无荧光) + CN- M-CN + 有机物(有荧光)2. 有机化合物的分析 1)芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发射荧光，可以直接进行荧光测定。例如蛋白质。2)对于某些不能发射荧光的分子，可以进行衍生化反应使其结合一个荧光基团从而能够

20、进行荧光检测和分析。例如氨基酸分析。42 3)间接荧光法 42五、荧光分析法新技术简介 1. 同步荧光光谱在同时扫描激发光和发射光波长的过程中，使激发波长（ex）和发射波长（em）保持固定的波长间隔。 43五、荧光分析法新技术简介 1. 同步荧光光谱432. 导数荧光光谱对荧光光谱图求导得到的导数曲线。可以在谱图上显示出微小的变化，使光谱图的分辨率得到了很大的提高。荧光光谱一阶导数光谱苯酚水溶液的B带吸收光谱(a)及其一阶(b)、二阶(c)导数442. 导数荧光光谱荧光光谱一阶导数光谱苯酚水溶液的B带吸收光3. 三维荧光光谱描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱，称为三维荧光光谱。

21、453. 三维荧光光谱454. 荧光免疫检测使荧光抗体与细胞表面抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。神经元免疫荧光细胞表面特异抗原464. 荧光免疫检测神经元免疫荧光细胞表面特异抗原46EXEM5 用于生物芯片的标记47EXEM5 用于生物芯片的标记474848小 结通常所说的“荧光”分析，其本质是光致发光，即依靠光能来激发分子产生荧光。荧光光谱是发射光谱，因而比紫外可见吸收光谱的灵敏度要高。荧光光谱的测定过程类似于紫外可见光谱的测定过程。进行荧光测定时受到散射光影响。49小 结通常所说的“荧光”分析，其本质是光致发光，即依靠第三节 化学

22、发光分析一、化学发光的基本原理在化学反应中，反应产物吸收反应的化学能而被激发到激发态，当跃迁回基态时以光辐射的形式放出能量称为化学发光。例如：发光强度与NO浓度成正比50第三节 化学发光分析一、化学发光的基本原理发光强度与NO浓度1 化学发光的条件1）化学反应必须提供足够的激发能，激发能主要来源于反应焓，大小在150400 kJmol-1，氧化还原反应可提供与此相当的能量。2）要有有利的化学反应历程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态。在液相中，芳香族化合物和羰基化合物更容易生成激发态的产物。 3）激发态能释放光子或能够转移它的能量给另一个分子，而使该分子激发，然后以辐射光子的形式回到基态。511 化学发光的条件512 化学发光的效率3 化学发光的强度在某一时刻t，发射光的强度I与化学反应的速度成正比。对于一级动力学反应，发光强度I与t时刻的反应物浓度成正比。需要高灵敏度的光检测器522 化学发光的效率3 化学发光的强度需要高灵敏度的光检测器5二、化学发光的类型1 直接化学发光和间接化学发光直接化学发光间接化学发光被测物A或B作为反应物生成激发态产物C*，C*直接辐射出光子。被测物A或B作为反应物生成激发态产物C*，C*不直接