维生素药物分析课件

1、第九章维生素类药物的分析基 本 要 求一、掌握维生素A的鉴别试验和紫外分光光度法测定含量。二、掌握维生素E的鉴别试验、特殊杂志检查和含量测定方法。三、掌握维生素B1的鉴别试验与非水溶液滴定法。四、掌握维生素C的鉴别试验与碘量法在原料药及其制剂中含量测定中的应用。五、熟悉维生素A、B1、C、D、E及其制剂的药典分析方法原理、特点及有关问题。返 回概 述维生素： 是维持人体正常代谢机能所必需的 微量营养物资。 人体不能合成维生素。 VitA、D2、D3、 E、K1 等 脂溶性水溶性 VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、泛酸等。分类按溶解度分返 回-H 维生素A醇-COCH

2、3 维生素A醋酸酯-COC15H31 维生素A棕榈酸酯R :第一节 维生素AVitA2VitA3 易发生脱氢、脱水、聚合反应鲸醇环氧化物VitA醛VitA酸三氯化锑反应（一）条件 无水无醇CHCl3 鉴别试验二、蓝色紫红去水VitA（VitA3）VitA立体异构体氧化降解产物合成中间体副产物UV法（一）含量测定三、维生素A2维生素A3环氧化物维生素A醛维生素A酸三点校正法（法定方法）1. 原理：（1）杂质的吸收在310340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；（2）物质对光的吸收具有加和性。2. 波长的选择：（1） 1 VitA的max（328nm）（2） 2 3 分别在1的两

3、侧各选一点测定对象 VitA醋酸酯第一法 等波长差法= 12nm第二法 等吸收比法测定对象 VitA醇1=325nm, 2=310nm, 3=334nm测定法（1）基本步骤:第一步 A的选择选择依据：所选A值中杂质的干扰已被基本消除第三步 求效价换算因数由纯品计算而得：第四步：求标示量 方法：（2） 第一法维生素A醋酸酯 判断 是否在326329nm之间在326329nm之间改用第二法是否 求算 并与规定值比较 规定值 差值 判断差值是否超过规定值的有一个以上超过无超过 计算 A328（校正） 用A328计算03%15%3%第二法第二法讨 论VA醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式法（即代数法

4、）推导而来；VA醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（几何法或称6/7定位法）推导而来。在应用三点校正法时，除其中一点在最大吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。在测定前务必要校正波长。测定的样品应不得少于两份。 VitAD胶丸中VitA的含量测定 精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物 0.1287g 至10ml烧杯中，加环己烷溶解并定量转移至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得

5、吸收度为A300 ：0.374A316 ：0.592A328 ：0.663A340 ：0.553A360 ：0.228A300 /A328 ：0.564A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.834A360/A328 ：0.344 求本品中维生素A占标示量的百分含量？A300 /A328 ：0.564A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.834A360/A328 ：0.344 0.555 0.907 1.000 0.811 0.299 + 0.010.01 0 + 0.02 + 0.04 =A

6、328(校正) = 3.52 ( 2A328 - A316 - A340 ) =3.52 ( 20.663 0.592 0.553 ) =0.637A328(校正) A328(实测)A328(实测)100 =0.637 0.6630.663100= -3.92E1%1cm( 328nm ) =A328(校正)100ms/D=0.6371000.1287/1250= 61.87供试品中维生素A效价= E1%1cm( 328nm )1900= 61.87 1900 =117553（IU/g ）标示量% =VA效价(IU/g) 每丸内容物平均装量(g/丸)标示量( IU/丸)100%=1175530

7、.0798510000100%= 93.9%注意p252页的练习题适用于维生素A醇（等吸收比法） 第一法无法消除杂质干扰时用此法 皂化法、6/7A法 （3）第二法水溶性脂溶性 判断max是否在323327nm之间取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定 计算是否 判断 A300 /A325 是否大于0.73是否取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定 计算A325(校正)03%3%练习题 维生素A醋酸酯胶丸的含量测定。操作如下：取内容物39.1 mg，加环己烷溶解并稀释至100 ml，在规定波长处测得的吸光度如下： 已知胶丸内容物平均重量为0.08736 g，其每丸标示量为3000IU，计算占标示量的百分

8、含量？中国药典规定的吸光度比值见下表。 解：由表可知328 nm的吸收度最大。 计算各波长的吸收度与328 nm波长处的吸收度比值（Ai/A328），与药典规定值比较，其中比值A300/A328与规定比值之差为0.026，比值A360/A328与规定比值之差为0.0348，超过规定的(0.02)限度，故需计算校正吸收度A328（校正）。A328（校正）=3.52(2 A328- A316 -A340)代入数值计算得：A328（校正）=3.52(20.671-0.607-0.55)=0.6512因为(A328（校正）- A328)/ A328=2.95% 3.0%故应以A328计算含量其中A32

9、8=0.671，供试品稀释倍数D=100，胶丸的平均内容物重量=0.08736 g = 87.36 mg，称取的内容物重量W=39.1 mg，比色池厚度L=1 mL，标示量为3000IU将数值代入计算公式得：标示量%=94.95%因此每丸胶丸内容物占标示量的百分含量为94.95%。三氯化锑比色法（二）优点 简便 快速max 618nm620nm标准曲线法缺点呈色不稳定 （5 10s内）水分干扰与标准曲线温差1专属性差三氯化锑有腐蚀性（二）蓝色+3SbClVitA返 回（三）高效液相色谱法RP-HPLC同时测定人血清中VitA和VitE的含量1、仪器与分析条件：HPLC-UV、C18 (3003

10、.9 mm）、甲醇水（96：4）、流速：1.2 ml/min、检测波长：08min (330 nm), 8 min后(292 nm）内标：维生素A醋酸酯血清样品的制备：LLE法制备分析方法的建立：线性、LOD、Recovery、PrecisionChromatogram:第二节 维生素D维生素D2骨化醇一、结构与性质维生素D3胆骨化醇开环的甾体：具有甾类化合物的显色反应，可用于鉴别。手性碳原子：具有旋光性，可用于鉴别。多烯：可进行紫外检测。性质：1、脂溶性2、不稳定性3、旋光性4、显色反应5、紫外吸收特性二、鉴别试验1. 显色反应醋酐-硫酸反应 D2 黄 红 紫 绿 D3 黄 红 紫、蓝绿 绿

11、 三氯化锑反应 橙红色渐变粉红三氯化铁反应 橙黄色二氯丙醇和乙酰氯反应 绿色2. 比旋度鉴别维生素D2维生素D3溶 剂 浓 度 比旋度值无水乙醇无水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5+107.5+105+112注意事项：应于容器开启30分钟内取样， 在溶液配制后30分钟内测定。 3.区别反应： 以96%乙醇为溶剂，加乙醇和85%硫酸，D2显红色，在570nm处有最大吸收，D3显黄色，在495nm处有最大吸收。 4.其他方法： TLC、HPLC、制备衍生物测熔点三、杂质检查维生素D2中麦角甾醇的检查：加洋地黄皂苷溶液，混合，放置18h不得发生浑浊或沉淀。前维生素D的光照产物四、含量测定方

12、法 中国药典（2000年版）采用正相高效液相色谱法(NP-HPLC）测定维生素D的含量，定量方法为内标法，内标物为邻苯二甲酸二甲酯。根据样品的具体情况按以下三个方法进行分析。第一法：用于无维生素A醇及其它杂质干扰的情况，步骤如下：1系统适用性试验：测定重复性和分离度。固定相：硅胶流动相：正己烷-正戊醇（997：3） 2测定校正因子： 3含量测定： 2,6-二叔丁基对甲酚加热第二法：用于有杂质的干扰的情况，步骤如下：1皂化处理：皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸除乙 醚、制备供试液A。2净化：供试液A经液相色谱分离，准确收集含有维 生素D及前维生素D混合物的全部流出液，制 备成供试液B。 固定相：O

13、DS 流动相：甲醇-乙腈-水（50：50：2） 3含量测定：取供试液B按第一法测定。第三法：用于经第二法处理后仍有杂质的干扰的情况。步骤如下：1制备供试液：取供试液A，净化，水浴加热，正已烷溶解，得供试液C。 制备对照液：对照品储备液（异辛烷溶解）：稀释、加热。2含量测定：在第一法的色谱条件下，交替精密进样 对照液和供试液，按外标法定量。返 回Discussion1、采用的是正相高效液相色谱法2、测定过程中应避免VitD的氧化3、皂化应剧烈振摇，水浴温度40，提取溶剂大多采用己烷或戊烷以消除苯的毒性4、若供试品中没有VitA醇及其它杂质干扰时，可以直接进样分析5、注意色谱系统适用性样品VitD

14、、前VitD的制备方法苯并二氢吡喃醇第三节 维生素E 名 称R1R2相对活性-生育酚-生育酚 -生育酚 -生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1*dl生育酚醋酸酯结构与性质一、苯环 + 二氢吡喃环 + 饱和烃链1、UV284 nm2、乙酰化的酚羟基 易水解緘緘緘瑌O醌型化合物生育酚緘緘緘緘畗緘-+or OHHVitE杂质，需检查緘O生育红（一）硝酸反应橙红色鉴别二、7515緘緘緘畗緘HNO3VitE生育酚（橙红色）生育红生育酚HNO3强氧化剂三氯化铁联吡啶反应（二）生育酚对-生育醌O弱氧化剂血红色 = 41.045.5max = 284nmmin = 254nm0.01

15、%无水乙醇中UV法（三）薄层板 硅胶G展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1）显色剂 硫酸（105 5） VitE Rf = 0.7-生育酚 Rf = 0.5-生育醌 Rf = 0.9TLC法（四）2. 游离生育酚 杂质检查 三、原理:利用游离生育酚的还原性，可被硫酸铈定量氧化 根据消耗硫酸铈滴定液的体积来控制游离生育酚的限量。酸度 以NaOH滴定液（0.1mol/L0.5ml）体积控制。（M生育酚= 430.8）例 取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过 1.0ml。2.15限量四、含量测定GC法（

16、法定方法）（一）GC特点1、选择性好灵敏度高速度快分离效能好挥发性低、不稳定、极性强衍生化易受样品蒸气压限制载气N2固定液硅酮（OV-17）担体硅藻土或高分子多孔小球柱温265检测器氢火焰离子化检测器(FID)内标正三十二烷 n 500 R2VitE测定的色谱条件2、内标法加校正因子内标法供试液（样品+内标）内标物对照液（对照+内标）是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近能与各组分完全分离与被测组分的量接近WWKK%VitE%10012=稀释倍数稀释倍数样对实际工作中的计算方法（二）HPLC法 RP-HPLC法、甲醇水（49：1）、 UV= 292 nm、外标法定量 返 回三、荧光分光光度法1、

17、药物本身具有荧光2、溶剂产生的拉曼光谱影响测定方法的灵敏度和准确度3、采用同步荧光扫描法测定，消除干扰同步荧光扫描法测定血清中VitE的含量1、仪器2、样品液的制备:样品测定管U、标准管S、空白管B3、测定方法：测定Fu、Fs、Fb4、计算：Discussion激发波长 295 nm发射波长325 nm普通荧光同步荧光选择合适的波长差来消除溶剂的干扰氨基嘧啶环CH2噻唑环(季铵碱)第四节 维生素B1HClCl-（一）溶解性1、易溶于水2、水溶液呈酸性（二）UV共轭双键max = 246nm结构与性质一、与生物碱（三）硫色素反应（四）嘧啶环 噻唑环 （五）盐酸根 呈氯化物的反应，用于鉴别。ChP

18、鉴别试验二、（一）硫色素反应硫色素2HVitB1H+H+H+H+（二）沉淀反应S元素反应Cl-反应（三）其他反应()瘆緘緘緘緘緘21PbSNa2SVitBNO3PbNaOH三、含量测定喹那啶红亚甲蓝（紫红天蓝）（一）非水溶液滴定法反应摩尔比为1：2片剂、注射剂= 421（每片）相当于标示量的%=A = ECL规格g/片g/100mlgChPWEA%cmD10011磢%100标示量平均片重含量测定紫外法测片剂中B1精称W g 100 mL 过滤 精取 5 mL 100 mL在246 nm处测吸光度推导下列公式，并求D=?含量测定紫外法测注射液中的B1量取v mL 200 mL精取 5 mL 10

19、0 mL 在246nm 处测吸光度（三）硫色素荧光法原理 1、荧光硫色素异丁醇铁氰化钾1VitBNaOH通过与对照品荧光强度的比较即可测得供试品含量2、实验操作 40 ml具塞试管3支对照品溶液5 ml；其中2支加入氧化试剂3.0 ml，再迅速加入异丁醇20 ml，振摇。第三支试管中加入3.5 mol/l的NaOH，同法操作为空白。 另取三支试管加入对照品同法操作。 各试管中加入无水乙醇2 ml，分取异丁醇，进行荧光测定。特点4、（1）灵敏度高，线性范围宽（2）代谢产物不干扰，适用于 体液分析（3）该法适用于VitB1的制剂含量分析（4）可用CNBr为氧化剂，反应定量完全，适合于生物样本分析第

20、五节 维生素CL抗坏血酸1、易溶于水2、水溶液呈酸性结构与性质一、（一）溶解性二烯醇结构二酮基结构二烯醇结构（二）还原性有活性有活性无活性糖类的显色反应50结构与糖类相似（三）具糖的性质C3OH的pKa = 4.17C2OH的pKa = 11.57酸性（四）一元酸L(+)抗坏血酸活性最强手性C（C4、C5）（五）光学活性*与碱反应（六）水解性与氧化剂的反应（一）鉴别试验二、去氢抗坏血酸OVitC1、与AgNO3反应2、与2，6 - 二氯靛酚反应(ChP2000)氧化型玫瑰红色还原型蓝色OH(ChP2000)（玫瑰色）（无色）3.其他氧化剂的反应：亚甲蓝或高锰酸钾 试剂褪色碱性酒石酸铜 砖红色沉

21、淀磷钼酸 钼蓝糖类的反应（二）或盐酸50吡咯USP（蓝色）(糠醛)戊糖50(吡咯)UV（三）BP0.01mol/L HCl三、杂质检查 1.溶液的澄清度与颜色：有色杂质 分光光度法2.铁、铜离子：原子吸收分光光度法猪肝勿与维生素C同吃维生素C是一种烯醇结构物质，易被氧化破坏，尤其是（如铜离子、铁离子），氧化更为迅速，特别是铜离子，既使微量存在，也可使维生素C和氧化速度加快1000倍之多。猪肝含铜、铁元素丰富，每100克猪肝中含铜2.55毫克，含铁25毫克。如果这二者同食，猪肝中的铜可催化维生素C氧化为去氢抗坏血酸，使维生素C失去原来的功能。因此，猪肝和维生素C最好不要同食。指示剂 淀粉指示液原

22、理1、碘量法（一）含量测定四、H+ 取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6方法2、（1）酸性环境 d . HCl （2）新沸冷H2O减慢VitC被O2氧化速度讨论3、（3）立即滴定 赶走水中O2减少O2的干扰（4）附加剂干扰的排除片剂 滑石粉 过滤注射剂 抗氧剂 丙酮甲醛Na2SO3 NaHSO3 Na2S2O3 Na2S2O5 CHHOOaS3aSO+H2NHON2252HONHCOS3a2，6

23、- 二氯靛酚钠滴定法（二）USPJP原理1、酚亚胺二氯靛酚，-62VitC自身指示终点法方法2、（2）快速滴定 2min内 （1）酸性环境 HPO3-HAc 稳定VitC防止其他还原性物质干扰（3）剩余比色测定 （定量过量）（测剩余染料）讨论3、（4）缺点 需经常标定贮存一周不稳定干扰多 氧化力较强三、高效液相色谱法人血浆中VitC浓度的HPLC法测定1、色谱条件2、标准溶液的制备3、血浆样品的处理：酸性溶液沉淀蛋白法4、方法学考察5、测定r=0.9995LOQ=1.0 g/mlRSDintra8.33%RSDinter4.36%RecoveryL=90.1%RecovereyM=95.4%R

24、ecoveryH=97.5%复方制剂中多种维生素的分析一、离子对HPLC法测定多种维生素 以能溶解于甲醇和水的樟脑磺酸为离子对试剂，以二巯基丙烷磺酸钠为抗氧剂，采用HPLC法同时测定多种Vit的含量1、色谱条件：色谱柱、流动相、检测波长2、样品液的制备：水溶性Vit(配制内标苯酚IS、标准液、样品液）脂溶性Vit（配制标准液和样品液）3、测定：水溶性测定波长272 nm，脂溶性测定波长 280 nm4、计算 外标法和内标法RP-HPLC法同时测定9种水溶性Vit的含量1、Apparatus and Reagents 二元泵HPLCUV N2000Workstation Standards:2、

25、Methods and ResultsChromatographic conditions:C18 column (2504.6, i.d., 5m)Mobile phase: 0.05 mol/l KH2PO4-CH3CN (97:3)-A and B (methanol) in Gradient elution mode as following:Detection wavelength: 210 nmFlow rate: 1.0 ml/minColumn temperature :Room temperature非水HPLC法同时测定4种脂溶性维生素VitA、VitD2、VitE、VitK11、仪器与试剂：HPLC、UV、N2000工作站、对照品购自中检所2、分析方法：色谱条件（流动相乙腈甲醇80：20），ODS，溶液的制备，方法学考察3、结果与讨论：如何优选合适的流动相公元