植物同工酶分析技术课件

1、实验 8植物同工酶分析技术什么是同工酶同工酶（isozyme，isoenzyme）是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶 。广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶。按照国际生化联合会（IUB）所属生化命名委员会的建议，则只把其中因编码基因不同而产生的多种分子结构的酶称为同工酶。最典型的同工酶是乳酸脱氢酶（LDH）同工酶。 同工酶的基因先转录成同工酶的信使核糖核酸，后者再转译产生组成同工酶的肽链，不同的肽链可以不聚合的单体形式存在，也可聚合成纯聚体或杂交体，从而形成同一种酶的不同结构形式。同工酶应用1、在生物学中，同工酶可用于研究物种进

2、化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。例如最原始的脊椎动物七鳃鳗（Lamprey）只有一种LDH肽链，进化到较高级的鱼类才有A、B两类肽链。又如通过对地理分布不同的物种间某一同工酶谱的普查可以推测物种的地理来源。动、植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别。法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系。细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用周工酶谱的比较来确定。在个体发育中，从胚胎到出生，再到成年，随着组织的分化和发育，各种同工酶谱也有一个分化转变的过程。某型同工酶在胚胎的大多数组织中出现，成为主要型式，称为原始型同工酶。但出生后在某些组织中逐渐减少而被另一型同工酶取

3、代，后者在胚胎组织中几乎不存在或含量极微，只在分化成熟的少数组织中存在，称为成年型同工酶。在植物的不同发育阶段，同样可见同工酶谱的相应改变。 2、在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段，癌瘤组织的同工酶谱常发生胚胎化现象，即合成过多的胎儿型同工酶。如果这些变化可反映到血清中，则可利用血清同工酶谱的改变来诊断癌瘤。此外。因同工酶谱有脏器特异性，故测定血清同工酶常可较特异地反映某一脏器的病变，如血清的LDH1（B4）或MB型肌酸激酶（CK-MB）增加是诊断心肌梗塞较特异的指标，较测定血清LDH或肌酸激酶（CK）总活力更为可靠。同工酶分离 同工酶分离方法主要有电泳法、层析法、酶学法和免疫学法等，

4、其中以电泳法应用最为广泛。其原理在于同工酶是功能相同但结构不同的一组酶，由于其结构中氨基酸序列或组成有差异，致使同工酶在电泳时，其迁移率也存在差异 电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品电泳方向 电泳带孔胶大分子 按分子大小分离 小分子影响电泳效果的因素1、带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；2、颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；3、溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；4、溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快； 5、电场强度：电场强度越小，电泳速度越

5、慢，反之越快；6、离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；7、电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；8、支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点1、聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；2、链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛的性质；3、网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有抗对流的作用；4、长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶；5、该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。过氧化氢酶 过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有

6、关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。一、实验目的1.通过实验掌握植物同工酶实验技术，了解植物同工酶分析在遗传学研究中的意义2.着重掌握过氧化物酶的提取，电泳与染色技术和分析方法。 三、实验材料黄豆和蚕豆四、实验器具和药品1、器具 电泳仪、垂直电泳槽、微量加样 器、Tip头、研钵、移液管、离心机。2、药品 三羟甲基

7、氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr） 、甲叉双丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、过硫酸铵、蔗糖、溴酚蓝、联苯胺、过氧化氢。3、电极缓冲液配制 Tris 3.0g,甘氨酸14.4g 加水至1000ml,pH8.8,使用时稀释10倍。4、染色液配制（过氧化物酶染液） 醋酸联苯胺溶液5毫升，3H2O2 2ml，H2O 93ml 5、加样和电泳 向各加样孔中滴加24l的样品酶粗提液。加一小微滴1溴酚蓝，在电压120V下进行电泳分离，根据指示剂位置确定电泳时间。电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，用刀片或薄板轻轻将玻璃夹层分开。 电泳缓冲液 加在槽中的样品夹在两块玻璃板之间的凝胶 电泳缓冲液电泳示意图分子量大分子量小电源6、染色 将完整的胶块置于染色器皿中，加入染色液，浸泡整块凝胶，室温下染色2030min，呈现酶带后取出胶块，用水漂洗以终止染色。 7、对带型清楚的胶应做摄影记录或做扫描测定，