微生物-育种课件

1、菌种选育的目的菌种选育的目的1.提供分子遗传学研究材料；2.分析生物合成机制；3.增加菌种遗传标记；4.了解菌种遗传背景。一、科研：1.产生新的生物活性物质；2.改变产品组分；3.抵抗不良培养条件；4.简化生产工艺； 5.适应原材料；6.缩短生产周期；7.合成新的化合物；8.改进质量；9.提高产量。二、生产：自然筛选自然筛选生产菌种3.从一些发酵制品中分离。一、从自然界分离所需要的菌株1.向菌种保藏机构索取有关菌株，从中筛选所需菌株。如：中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM）；美国典型菌种保藏中心(ATCC)；英国国家典型菌种保藏中心(NCTC)等。2.由自然界采集样品。自然筛选自然筛选生

2、产菌种二、把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。样品的采集具体步骤：（一）、从土壤中采样细菌（108）放线菌（107）霉菌（106）酵母菌（105）藻类（104）原生动物（103）根据土壤有机质含量，通气状况，酸碱度，植被状况，地理条件（南 方较好），季节条件（秋季最佳）一、含微生物样品的采集富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境中地优势种，以利分离到所需要地菌株。主要根据微生物的碳、氮源、pH值、温度、需氧等生理因素加以控制。二、富集

3、培养注意：如果按通常分离方法在培养基平板上能出现足够多数量的目的微生物，则不必进行富集培养。（二）、控制培养条件 如：细菌、放线菌生长繁殖pH 7.0-7.5 霉菌、酵母菌生长繁殖pH 4.5-6（一）、控制培养基的营养成分三、分离稀释平板法（一）、稀释平板法（pour plate method）将含微生物的样品用无菌生理盐水进行梯度稀释，取少量与冷却至50的固体培养基混合，摇匀，倒混菌平板或涂平板，倒置培养24小时，出现菌落。适用于：数量占优的微生物。好氧，在平板上形成菌落的微生物。不适用于：相反。25g或25mL225mL无菌生理盐水1mL9mL10-110-210-310-610-7倒平

4、板平皿划线分离法（二）、平皿划线分离法：连续划线交叉划线方格划线扇形划线适用于：好氧，能在平皿上形成好的菌落。生化反应分离在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基浑浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。分解水解酶产生菌时多采用，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌。（三）、利用平皿的生化反应进行分离1.透明圈法：透明圈法（1）分离淀粉酶产生菌：以淀粉为唯一碳源，样品涂布培养形成单菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。（2）分离核酸水解酶产生菌：普通平板，样品涂布培养长出菌落后覆盖一层营养琼脂，内含3%酵母RN

5、A，0.7%琼脂及0.1mol/L EDTA, pH 7.0,于42左右培养2-4小时，挑四周产生透明圈的菌落。（3）分离某种产生有机酸的菌株：选择培养基+CaCO3变色圈法（1）筛选果胶酶产生菌0.2%果胶为唯一碳源培养基平板涂布培养长出菌落后，加入0.2%刚果红溶液染色4小时，具有分解果胶能力的菌落周围会出现绛红色水解圈。2.变色圈法在底物平板中+指示剂或显色剂抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选。培养基+抗生素的敏感菌（作为检验菌）+被检菌采用冷敏感菌筛选抗生素突变株，Giuseppe Satta 等从人的病源菌中诱变分离低温敏感菌突变株（冷敏菌），在20以下不生长。将冷敏菌+放线菌孢子

6、混合于平板上20培养3-4天，放线菌生长产抗生素，再移至37培养18-20小时，冷敏菌迅速生长，观察抑菌圈。4.抑菌圈法变色圈生长圈抑菌圈透明圈单细胞或单孢子分离法滤纸片法：取与皿内径大小一致的滤纸3-4层，浸在培养液中，取出放在空皿内，在滤纸上滴几滴甘油以防干燥，盖好皿盖，灭菌。将稀释为1500ml-1的孢子悬液用滴管滴在滤纸上，每皿约点20滴左右，经恒温培养，每滴约出现10个菌落，将单菌落移接于斜面上。（五）、单细胞或单孢子分离法通过控制营养和培养条件进行分离1.控制培养基的营养成分如特殊菌类-环保降解菌（降解烃类、有机染料、表面活性剂、农药等）的分离：以该物质为唯一碳源或氮源进行长时间（

7、几个月的连续培养）富集培养。2.控制培养基的pH3.排除不需要的菌类4.控制培养温度（六）、通过控制营养和培养条件进行分离厌氧微生物的分离1.加还原剂于培养基中如半胱氨酸等。2.去氧 ：焦性没食子酸 + NaOH（七）、厌氧微生物的分离厌氧微生物分离装置四、筛选和目的产物的鉴别2.摇瓶发酵筛选摇瓶振荡培养得发酵液 待测平板打孔(厚3mm 内径5mm钢圈打孔)+过滤后的发酵液10ul或灭菌圆滤纸片上滴入1-2ul发酵液代替打孔孔或滤纸片的周围出现活性圈（溶菌圈或水解圈），根据其大小判定活力大小1.平板筛选这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业

8、生产用菌种。五.毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。诱变育种诱 变 育 种以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。.提高有效产物的产量；.改善菌种特性，提高产品质量；.简化工艺条件；.开发新品种一.育种目的.了解出发菌株：适宜的培养条

9、件、温度、湿度、培养基、固体培养基上的菌落情况。2.建立一个准确、简便、快速检测产物的方法。3.研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件。二.准备工作出发菌株的选择1.自然选育的具有一定生产能力的野生或至少能少量产生目的产物的菌株。2.具有有利性状的菌株，如生长速度快，营养要求低以及产孢子早而多的菌株。3.选择已发生其它变异的菌株。4.采用“增变菌株”（对诱变剂的敏感性比原始菌株大为提高）的变异菌株。三、步骤与方法（一）出发菌株的选择单细胞或单孢子悬液的制备*诱变育种工作中，一般采用3-4个出发菌株，在逐代处理后，将产量高、特性好的菌株留作继续诱变的出发菌株。（二）单细胞或单孢子悬液的制备采用对数期

10、细胞或成熟而新鲜的孢子：用发芽孢子（芽长为孢子 0.5-1倍）或直接用斜面孢子。不产生孢子的真菌采用年幼的菌丝体。均匀的悬液。诱变剂及诱变剂量的选择（三）诱变剂及诱变剂量的选择（1）物理诱变剂非电离辐射（只使物质分子或原子中的电子级能提高）-紫外线1.诱变剂的种类紫外线诱变机制紫外线诱变机制形成胸腺嘧啶二聚体；嘧啶间的水合作用；DNA与蛋白质交联，DNA分子间交联；DNA链断裂。紫外线最有效的波长是2537埃。采用15w紫外线灯管，30cm距离。电离辐射射线种类放射源性质能量范围危险性透过组织的深度X射线X 光机电离辐射50-300kv危险，有穿透力几mm-几cm射线放射形同位素及核反应同上达

11、几百万ev同上1cm中子核反应堆或加速器不带电子的粒子1ev-几百万ev危险性高，穿透力强1cm粒子放射性同位素或加速器电子几百万ev有时有危险1cm粒子放射性同位素氦核2106-9 106ev内照射，很危险1cm电离辐射：杀菌率90%-99.9%其它物理诱变剂：微波、红外线、激光、高能电子流等。化学诱变剂(2).化学诱变剂缺失诱变剂名称诱变效应羟胺亚硝基胍（NTG）吖啶类亚硝酸5-BUGC ATAT GC 颠换移换回复效应+/ +化学诱变剂大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射

12、进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。使用化学诱变剂的优缺点：诱变剂的选择碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺失突变。但它可能影响邻近基因的性能。2

13、.诱变剂的选择诱变剂量的选择（1）处理剂量大，杀菌率高（90%-99%），在单位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少。（2）用小剂量进行诱变处理时，杀菌率约50%-80%，在单位存活细胞中正变株多，然而大幅度提高产量的菌株可能较少。3.诱变剂量的选择诱变剂量的选择（3）化学诱变剂主要是调节浓度、处理时间、处理条件（温度、pH值等）。物理诱变剂主要是控制照射距离、时间和照射过程中的条件（O2、水等）。诱变剂处理方式（1）单因子处理处理1次连续重复使用（2）复合因子处理两个以上因子同时处理不同诱变剂交替处理4.诱变剂处理方式中间培养（四）中间培养 由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程

14、，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。中间培养方法 方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。突变株的分离与筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差

15、异. 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。（五）突变株的分离与筛选筛选程序1.筛选程序常规法（1）常规法诱变第一代：出发菌株分离到平皿上（结合指示剂、呈色剂或底物等）挑选菌落（200个）初筛1瓶/株50株复筛3-5株（提供第二代诱变出发菌株）第二代：出发菌株4株诱变分离到平皿上（结合指示剂、呈色剂或底物等）挑菌落100个菌落100个菌落100个菌落100个菌落初筛1瓶/株50株复筛3-

16、5株（提供第三代诱变出发菌株）第三代、第四代直到选育到符合要求的优良菌株。简便法2.简便法第一代：出发菌株诱变分离到平皿上打琼脂块菌落1000-3000块检定板上挑取5%-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落初筛1-2瓶/株30-50株复筛3-5瓶/株3-5株（提供第二代诱变出发菌株）第二代：出发菌株4株诱变分离到平皿上打琼脂块1000-3000块检定板上挑取5%-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落初筛1-2瓶/株30-50株复筛3-5瓶/株3-5株（提供第三代诱变出发菌株）第三代、第四代直到选育到符合要求的优良菌株。特点（1）分离采用琼脂块法； （2）初筛摇瓶发酵液中产物分析采用简便、快速

17、的琼脂平板测定法或其他简便方法。随机筛选2.筛选方法出发菌株诱变平皿生长出菌落随机挑选菌落于斜面接种三角瓶振荡培养测定产物活性的高低，决定取舍缺点：如果菌落挑取少了，很难筛选到理想的突变株（因为突变概率小）（1）随机筛选（摇瓶筛选）初筛方法平板菌落筛选 可根据菌落形态或利用菌落产生的代谢产物与培养基中检定菌、底物或指示剂作用后，在其周围形成抑菌圈、呈色圈或其他特异性反应圈，测定反应圈直径。如：红霉素诱变突变株带色素（低产株）产孢子菌诱变不产孢子突变株由突变引起形态剧烈变化的菌落（负突变多）（2）平板菌落筛选（摇瓶初筛前的一种预筛）根据菌落形态突变的高产菌株其菌落形态往往在常态的正常范围内，因为

18、它们的遗传物质仅受到微小损伤，还保留了正常代谢的基本功能。一个菌株的高产性能是经过多代微小突变累积的，一代诱变后的菌落形态与直接亲本之间形态变化一般不明显，但经长期多代诱变后，高产菌株与其最原始的亲代在形态特征上还是有明显差异。根据平板菌落生化反应筛选浓度梯度法加入抗生素上层不加抗生素，接种涂平板低浓度高浓度(3).浓度梯度法琼脂块法 日本人八木建立，此法广泛用于抗生素和酶类等突变株的筛选。 优点：准确性比直接平板上特异性反应圈更可靠；方法较为简便；筛选量很大，一次可筛选琼脂块上的菌落达1000-3000个或更高。（比常规筛选量提高15-20倍）（4）琼脂块法单孢子悬液诱变接种到琼脂平皿上（2

19、0-50个菌落/皿）用直径6mm打孔器每皿80-120琼脂块直径9 cm平皿中加入20ml培养基保持一定湿度29，4-5天生物鉴定平板每板130-150块含供试菌种29，17-18小时选出菌落接入斜面其他复印技术应用：从平板上可直接筛选产脂野生株和具有高脂含量的突变株，是产脂微生物的简便检测方法。步骤：诱发产脂的限氮培养基制平板，接种30培养3-4天。在平皿上覆盖一张滤纸（直径9cm，1号），用“丝绒印模”轻压后取出已复印菌落的滤纸，置于50，干燥20min。（5）其它将滤纸浸入含苏丹黑（质量体积比为0.08%，溶剂95%乙醇）溶液的平皿内，染色20min。取出滤纸，放入95%乙醇平皿中轻摇3

20、min去多余染料。取出放入95%乙醇平皿中脱色5min。将滤纸干燥，高脂酵母菌落呈现深蓝色或紫色，而低脂菌落为浅蓝色或无色。摇瓶液体培养其培养条件接近于发酵罐，可作为发酵工艺模拟试验，选出的菌种易推广到大生产中去。初筛：1瓶/株，逐个进行活性测定，凡生产能力比出发菌株高10%以上的进行保种和复筛。复筛：3-5瓶/株，观测重复性。*注意：培养条件要尽量与大生产发酵条件相近。培养条件的相似性：摇瓶型号、装量、瓶塞厚度、摇瓶转速、温度、摇瓶位置、室内相对湿度等。复筛方法摇瓶液体培养产物活性测定一般突变规律：一个出发菌株通过一次诱变，生产能力提高5%的突变株约为1/50，而生产能力提高10%以上的突变

21、株约为1/300。通常诱变一代至少要挑选1000株以上，经平皿预筛后，约保留200株进行摇瓶初筛。经典法：蛋白酶测定采用分光光度法；脂肪酶测定采用NaOH滴定法；。缺点是操作繁琐、样品不能同时测定，带来误差。（六）产物活性测定培养基和培养条件的调整快速检验法：琼脂平板活性圈法：平板打孔加入发酵液或滤纸片浸透发酵液覆盖于琼脂平板上（加有检验菌或底物）。其他法（七）培养基和培养条件的调整紫外线的诱变育种实例一 紫外线的诱变育种 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537埃灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量

22、死亡率控制在7080%为宜。被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。操作步骤单细胞悬液制备 将细菌培养液以3000rmin离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。 将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个ml左右，作为待处理菌

23、悬液。操作步骤紫外线照射 取24m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射1050s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。 杀菌率计算 取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5mL进行稀释分离，计数活菌细胞数。 中间培养 取照射菌液2mL于液体培养基中(300mL三角瓶内装30mL培养液)，120rmin振荡培养46h。 分离、筛选 取中间培养液稀释分离、培养。挑取菌落进行筛选。亚硝基胍诱变曲霉菌实例二 亚硝基胍诱变曲霉菌 N甲基N-硝基-N-

24、亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。 单孢子悬液制备 取斜面，加入6mL 0.1molL pH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个mL，此为待处理孢子悬液。 MNNG溶液的制备 用分析天平称取2mg，加入2mL 0.1molL pH 6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。操作步骤操作步骤 单孢子悬液制备

25、 取斜面，加入6mL 0.1molL pH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个mL，此为待处理孢子悬液。 MNNG溶液的制备 用分析天平称取2mg，加入2mL 0.1molL pH 6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。诱变处理 吸取MNNG溶液lmL，加入到1mL孢子悬液中，30振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30 3天后计数。 死亡率计算 将未处理的孢子液1mL加入1mL磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离， 30下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计

26、算出死亡率。分离、筛选 挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选营养缺陷型菌株的筛选实例三、营养缺陷型菌株的筛选2.营养缺陷型（auxotroph）：由于基因突变引起代谢过程中某种酶合成能力丧失的突变型，它们必须在原有培养基中添加相应的营养成分才能正常生长。1.野生型菌株（wild typestrain）：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株。一、定义：基本培养基（minimal medium, MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长所需的培养基。用-表示。不同微生物的基本培养基是不同的。补充培养基（supplemental medium, SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培

27、养基。由MM+该菌株不能合成的营养因子而组成。完全培养基（complete medium, CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需求的天然或半合成培养基。用符号+表示。一般可在MM中加入富含氨基酸、维生素和碱基之类的天然物质配制成。（一）营养缺陷型的诱发：亚硝基胍、紫外线、亚硝酸等作诱变剂。二、步骤：淘汰野生型菌株（二）淘汰野生型菌株细菌：青霉素法（抑制肽聚糖交链）真菌：制霉素法（作用于细胞膜上的甾醇，引起细胞膜损伤）将诱变处理后的菌体用CM振荡培养2-3代后，离心、洗涤菌体，转移至MM中饥饿培养4-6小时，转至MM中（+20%蔗糖）培养3-4小时，加一定浓度的青霉素。1.抗生素法：+MM振

28、荡培养约10小时，用灭菌的脱脂棉或滤纸等除去菌丝。继续培养，每隔3-4小时过滤一次，重复3-4次。诱变，MM振荡培养，加热至80。2.菌丝过滤法（丝状菌）3.高温杀菌法（芽孢菌）（三）营养缺陷型的检出点植对照法1.点植对照法（点种法）CMMMCM突变株影印法2.影印法CM8cmMM高10cm+0.5%脱氧胆酸钠防止菌落扩散Yi 夹层法3.夹层法（延迟补给法）MM（薄）MM（含菌）MMCM最上层MM倾注后培养24小时，非营养缺陷型菌株生长成菌落，再倾注最后一层CM，在MM上不长，后在CM上长出的小的菌落为营养缺陷型菌落。限量补充培养法限量某种营养物质（如0.01%蛋白胨），野生型长出大菌落，缺陷

29、型长出小菌落。4.限量补充培养法营养缺陷型的鉴定（四）营养缺陷型的鉴定1.测定缺陷型菌株所需生长因子的类别（哪类的判定）（1）氨基酸混合物（21种）；（2）维生素混合物（15种）；（3）核酸碱基混合液或酵母核酸（0.1%）；（4）酵母浸出液。待鉴定菌从斜面上用生理盐水刮洗，离心洗涤，制成106-108个/ml的菌悬液，取0.1ml加入MM中，混匀到平皿，凝固后用滤纸片分别沾各类物质覆于平板上，培养后观察生长圈。2.具体测出缺陷型所需生长因子分组测定1963年Epstein.R.H.最先研究。在许可的温度下能正常生长，在非许可的温度条件下不能生长或微弱生长，表型与野生型不同，这种条件致死突变株即

30、Ts突变株。温度敏感突变株温度敏感突变株（temperature-sensitive mutant）的筛选Ts突变株累积中间发酵产物的机理：突变导致某种酶的结构发生改变，即突变体的酶蛋白一级结构氨基酸序列发生了变化，而酶的活性中心并未发生改变。在许可温度下培养时，酶活力、菌体生长和代谢均正常。当菌体生长到一定阶段，转移到非许可温度时，突变株生长停止，酶活力逐渐丧失，从而使发酵目的产物得以不断合成累积和往外分泌。筛选步骤：1.诱变：亚硝酸、紫外线等。2.富集：因为频率极低（0.1%）（1）抗生素法（2）过滤或离心法（3）H3-前体法：诱变后菌体在非许可温度下培养，培养基中+相应的H3-前体物（如

31、+H3-尿嘧啶筛选RNA合成缺损的Ts突变株），野生型菌株或其它大分子合成缺陷型Ts都可吸收H3-前体物，3.分离筛选：主要根据菌株在高于或低于最适生长温度5-15的生长状况。一般细菌 30为许可温度，40为非许可温度；放线菌 30为许可温度，38为非许可温度；酵母菌 23为许可温度，36为非许可温度。并掺入合成为细胞物质。含有H3-前体物的细胞在长时间低温保存过程中由于射线损伤而死亡。谷氨酸发酵高产途径1.菌量达一定后添加表面活性剂（土温80）或抗菌素（青霉素），阻止细胞膜或细胞壁的结构合成，从而提高细胞膜的透性，促使Glu大量外泄/2.诱变筛选生物素缺陷型：在培养基中加入亚适量生物素，有利

32、于Glu的产量提高。例：谷氨酸发酵高产途径4.诱变筛选细胞膜结构或功能缺损的Ts突变株，通过温度调节来控制细胞膜透性，使菌体能在含高浓度生物素的培养基中能分泌大量Glu。3.诱变筛选油酸或甘油缺陷型，限量供给油酸或甘油以控制细胞膜磷脂的含量和组成，促使Glu外渗。基因重组育种自然存在原核微生物中基因重组方式转化（transformation）受体菌直接吸收来自供体菌的DNA片段通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得供体菌的部分遗传性状的现象。转化现象在肺炎链球菌、葡萄球菌和流感嗜血杆菌等中被证实。转化因子（transforming principle ）在转化过程中，转化的DNA片段称为

33、转化因子 ，分子量小于107，最多不超过10-20个基因。感受态（competence）受体菌只有处于感受态时，才能摄取转化因子。细菌处于感受态是因为其表面有一种吸附DNA的受体.转化图接合（conjugation）接合是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。 接合性质粒：能通过接合方式转移的质粒称为接合性质粒，F质粒、R质粒、Col质粒和毒力质粒。F、F、HfrF+与接合F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipientHfr高频重组菌株F+F+HfrHfr与F接合HfrF-HfrF-HfrF-HfrF-F与接合FFFFFF-FF-转导（t

34、ransduction）转导是以转导噬菌体为载体，将供体菌的一段DNA转移到受体菌内，使受体菌获得新的性状。 普遍性转导（generalized transduction）局限性转导（restricted transduction）普遍性转导完全缺陷型噬菌体：病毒蛋白质衣壳包裹着一小段宿主的DNA。部分缺陷型噬菌体的产生过程普遍性转导与局限性转导的区别区别要点普遍性转导局限性转导基因转导发生的时期裂解期溶原期转导的遗传物质供体菌染色体DNA任何部位或质粒噬菌体DNA及供体菌DNA的特定部位转导的后果完全转导或流产转导受体菌获得供体菌DNA特定部位的遗传特性转导频率受体菌的10-7转导频率较普遍

35、转导增加1000倍(10-4)真核微生物基因重组方式1、有性杂交有性细胞的接合和随之发生的染色体重组。二、真核微生物基因重组方式能产生有性孢子的酵母和霉菌2、准性生殖（parasexuality）是真菌中不产生有性孢子的一种导致基因重组的过程。类似于有性生殖而又比它更原始的一种繁殖方式。原生质体育种 原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。原生质体融合是将两种不同的微生物细胞经酶等方法处理，去掉细胞壁成为原生质体后进行融合的过程。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上

36、提出来的。原生质体融和原生质体融合育种的特点(一)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。(二)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。(三)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。 (四)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。（五有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 (六)提高菌株产量的潜力较大。 (七)有助于建立工业微生物转化体系。原生质体融合育种步骤标记菌株的筛选和稳定性验证。原生质体制备。等量原生质体加聚乙二醇促进融合。涂布于再生培养基，再生出菌落。选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。生产性能筛选。原生质体融合原生质体融合原生质体融合育种的要点获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或和抗药性菌株。最重要的是标记必须稳定。采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。（一）标记菌种的选择（二）原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。 在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母