流式细胞仪操作方法

1、-. z.一、样品制备1、取样大约1106cells，离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴参加1ml 70%的冷乙醇固定细胞，20冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，参加100l的RnaseGenScript试剂A，37水浴30min，然后再参加400l的PI染液GenScript试剂B，在4避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2104cells，二、上流式测细胞1.1、翻开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；翻开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow，拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。

2、检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀翻开，倒掉废液加鞘液一定要倒废液向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。1.2、依此接通电源、翻开稳压器电源指示灯由bypass变Ac putput、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur开关翻开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印，翻开打印机电源。翻开电脑密码：BDIS，等待屏幕显示出标准的苹果标志先开仪器，后开电脑主机。1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，翻开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。假设滤器管路中有气泡

3、，翻开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡反向压力使鞘液从进样针中流出。完毕后自动STANDBY，5分钟后即可进展试验。2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，翻开，Plot type选择Acq-analysis，*参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群。选择单参数图标，翻开，Plot type选择Acq-analysis，*参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长*围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,应选择FL2-H) 2.2、从屏幕上

4、方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer快捷键：B进展电脑和仪器的连机。此时出现Parameter description对话框,选择BD files,设置文件存放的位置在Acquire指令栏中，选择Parameter Description，以决定文件存储位置(folder)，文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel)，即安排tube1，2，3的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStation G3BD Applications CELLQuest *和DNA 文件夹中。文件根据日期命名。同时将出现的Acquis

5、iton Control对话框,将其移至适宜位置。2.3、从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps，Threshold，pensation，Status等四个对话框，并将他们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取文件。也可以用&+1，2，3，4获得此四个对话框。2.4、在Detectors/Amps可通过调整电压，是FSC、SSC放大或者缩小对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式amplifiermode：线性模式Lin或对数模式Log。一般进展细胞外表抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC和SSC多以线性模式Lin测量，且DDMParam选择FL2，而FL1，

6、FL2，FL3皆以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Lin进展测量，且DDMParam选择FL2；分析血小板表型时， FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Log进展测量。在Threshold对话框中选择适当的参数设定阀值，并调整Threshold的上下，以减少噪音信号(细胞碎片)。一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA时用FL2-H。Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。在pensation对话框中，根据所用的调整补偿用标准荧光样品调整双色或多色荧光染色所需的荧光补偿。.在Status对话框中，LaserPowe

7、r：正常值Run/Ready为14.7mW，Standby为5mW；LaserCurrent：正常值为6Amps左右。2.5、通过预设的获取模式文件进展样品分析。 从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings，在其对话框中选择Open以调出以前存储的一样实验的仪器设定，按Set ,Done确定。2.6、加样:混匀、上样、按run放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN，流速可在HIGH或LOW上2.6.1.工具板中选择多角形区隔工具， FSC/SSC散点图上， R1区域的界定，我们将以此区域来圈选本次测量的细胞。(如果要删除R1区域，您可以在工具栏中点选Gates

8、Region list，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。)在单参数的图上，gate位置选择G1=R1 使在单参数的图上显示的是R1区域的细胞的荧光。2.6.2选择acquire-counters翻开计数器，本实验计数10000个细胞为准。测量期间，几十秒后待电压稳定，点击Abort，去掉勾选setup开场测量，如需暂停请按stndby， 可按run继续。三、样品分析使用Modfit软件分析数据。翻开file-选择需要分析的文件。Define gate 1选择 *：FSC-H Y：SSC-H 点击OKDefine gate 1选择

9、*：FL2-W Y：FL2-A 点击OK以上分别选择适宜的*围 一个是对细胞的处理 一个是对荧光的处理点击Mode -OK点击Fit 四、流式细胞仪使用完毕后的维护从File中选择Quit, 退出软件，选择Dont Save至苹果屏幕。将4ml 1：10稀释的次氯酸钠溶液10%稀释至1% 用滤纸过滤后作样品，将样品置于旁位vacuum is on，以外管吸去约1ml，在将样品架置于中位vacuum is off，再HIGH RUN 10分钟内管吸去2ml。改用三蒸水6-10ml作样品,同上处理，但是使用三蒸水的量一定比次氯酸钠的时间更长以清洗掉次氯酸钠残夜。仪器置于STANDBY状态10分钟，依次关掉计算机、打印机此二者可以提前关掉、液流抽屉内的压力阀，FACSCalibur开关、变压器、稳压电源置于(OFF)，以延长激光管寿命，并确保应用软件的正常运行。并填写使用登记表。五、月维护程序清洗液为有效浓度为1-2%的次氯酸钠溶液5.1将压力阀关闭，将鞘液桶取出换上专门用于月维护的鞘液桶，内装1-2%的次氯酸钠溶液2/3，将鞘液过滤器短路，即将过滤器连接头saline filter断开，将鞘液白色液路管路取下，然后连接至saline filter端口，使鞘液直接进入流动室。