分子生态学课程教学难点的解析-3个种群遗传分析方法简介

1、分子生态学课程教学难点的解析3个种群遗传分析方法简介摘要随着分子生态学的迅猛发展和广泛应用，分子生态学已成为很多大学本科和研究 生的专业课程。分子生态学教学过程中涉及复杂的种群遗传学统计分析方法,是教学的难点。 然而对于分析方法的正确理解和使用，是这门工具课程教学的关键。本文将分子生态学课程 中,种群遗传学分析方法中的3个难点进行解析和介绍，以期帮助学生理解和辅助教师教学。关键词分子生态学哑等位基因连锁不平衡哈温平衡中国图书分类号:Q75文献标识码:A分子生态学是在分子水平上研究和解释有关 的生态学和环境问题的一门交叉学科，自20世 纪中叶诞生以来发展迅猛，已成为科学研究中非 常基础的实验手段

2、2-3o分子生态学这门课程也逐 渐进入大学本科生和研究生的教学中46，已有多 所高校开设该课程。分子生态学是分子生物学与 生态学等多学科的交叉学科，涵盖的知识面极广, 涉及多个学科,包括动物学、植物学、微生物学、 普通地理学、生态学、种群与群落生态学、行为生 态学、生物化学、遗传学等，由于其内容广泛,交 叉性强，学生理解和掌握往往存在一定困难。该课 程着重介绍各种分子生态学理论与分析方法，旨 在让学生理解生态学，尤其是种群遗传学的理论 知识，掌握分子生态学实验方法及如何利用理论 知识分析和解释实验数据。在分子生态学课程;， 分子标记的使用方法、分析方法，以及涉及的理论 背景是整个课程的核心。其

3、中对分子标记的实 验结果的分析主要依靠现有的软件，教师的讲解深度也多限于对软件给出结果的简单解释，涉及 的计算原理、数学方法及种群遗传学理论很难深 入讲解46$%然而分析过程;，对分析原理的深入 理解决定了对结果解释的高度和准确性在分子生态学的课程设计;，会以12种经典 的和当前流行的分子标记为例进行讲解，包括蛋白 质标记(等位酶标记)和DNA标记(RFLP、RAPD、 AFLP、SSR、SNP、RAD、MSAP、Hiseq 等)#$% 这些标 记虽然有差异，但其背后的种群遗传学原理都是相 通的其中微卫星标记(SSR)作为一种廉价且广泛 应用的方法，在分子生态学课程;经常被作为代表 标记进行讲

4、解和设计实验，甚至有些课程直接以微 卫星分子标记作为贯串课程的主线#7-:$%微卫星标记被广泛应用于种群生态学研究 ;9-10%微卫星通常又被称为简单重复序列(SSRs)、 短串联重复(STRs)，是短的DNA重复片段，其中重 复单元(motif) 般为16个碱基，广泛存在于原核 和真核生物基因组;11%个体间相同位点上可能存 在着重复次数的不同，导致基因长度的差异通过 PCR和毛细管电泳可检测出基因长度，区分不同等 位基因#12$%微卫星标记具有高突变率13、符合孟德 尔遗传规律的共显性标记等特点#12$%在分子生态学 和种群遗传学的工作;，微卫星标记可用于亲本分 析、评估近交水平及估计种群

5、的遗传结构、瓶颈效 应、有效种群大小和基因流等10-14%然而在学习微 卫星标记的分析方法过程;，有很多问题学生难 以理解，使用过程;容易产生误解，甚至对分析结 果的解析产生错误本文将分析过程;最重要的 哈温平衡(Hardy-Weinberg equilibrium )检验、评估 连锁不平衡(linkage di sequilibrium )及估计哑等位 基因(null allele)频率的原理进行介绍和解析，以 期帮助学生理解和辅助教师教学1 哈温平衡检测哈迪-温伯格平衡(简称为哈温平衡)法则是 种群遗传学;最重要、最基础的法则，它解释了繁 殖如何影响群体的基因和基因型频率，是由英国 数学家

6、Hardy和德国的医生Weinberg分别于1908 年和1909年提出%他们提出，在一个不发生突变、 迁移和选择的无限大的相互交配的群体;，基因 频率和基因型频率在代际之间保持不变#15$%哈温 平衡法则是检验群体有性繁殖上、 下代之间基因 频率与基因型频率是否保持平衡的重要方 法16-17O哈迪-温伯格模型在种群遗传学领域的地 位和作用几乎是无可比拟的，奠定了种群遗传学 的基础几乎所有的进化理论都是从哈温平衡条 件出发,然后再考虑某个或某些进化过程所以在 进行种群分析;，哈温平衡检测几乎是分析的第 1步哈迪-温伯格模型也广泛应用和出现在中学 和大学教学;15,17-18O随着统计学的发展和

7、软件的开发，对哈温平 衡检测的检测也从最简单的卡方检验(Chi-square test),逐渐加入马尔科夫链算法,以及对卡方检验 进行矫正的列联表的Fisher精确检验(Fisher s exact test)方法 %卡方检验是检测哈温平衡最简单的方法通 过比较观测基因频率和哈温平衡下的期望基因频 率实现卡方检验虽然比较容易并且易懂，但是检 验效力较低%相比之下，Guo和Thompson所描 述的马尔科夫链随机游走;法(Markov- chain random walk algorithm)则是更有效的检验方法这 种方法使用类似2x2列联表的Fisher精确检验方 法，只是该方法使用了任意大小

8、的三角列联表%该 检验使用修饰过的Guo和Thompson所描述的马 尔科夫链随机游走算法。修改过的版本与原算法 结果)一致，但计算速度更快%该方法首先建立一 个KxK的列联表%其中，K表示等位基因的数目， 列联表内的数值是等位基因的观测频率使用 Levene的算法如计算在零假设下观测到此表的概 率，然后使用马尔科夫链算法搜索边缘计数 (marginal counts )等的替代矩阵%其中，随机选 择2行i$、i2和2列j$、j2,通过减少(il，jl) (i2，j2)并 且增加(iI，j2)(i2，jI)以获得新表%通过计算转换概 率决定是否接受新表 P值为所有访问过的表中 概率比原表小或)

9、等的比例在教学过程;，教师通常使用软件进行哈温平 衡检验，并直接用软件给出的P值以评估种群是否 处于哈温平衡而对检验背后得原理甚少提及而 在种群遗传学分析;，找到影响哈温平衡的因素往 往是找到影响种群进化的关键，例如，近交、亚种群 结构等，都可能是导致种群偏离哈温平衡的原因 所以，理解哈温平衡检测的原理，能帮助学生在进 一步分析;对实验和数据进行正确的解释 2评估连锁不平衡在数据分析过程;每一个位点都应是从基因 组中的独立采样，但是如果不同位点在染色体上 物理位置过近,则会导致2个位点连锁,这种情况 被成为连锁不平衡。如果实验;2个位点出现连 锁,则在进一步分析过程;就会导致假重复,影响 数据

10、分析的准确性。Raymond和Rousset#23$提出一种基于列联表的 Fisher精确概率检验延伸的算法,以计算连锁不平 衡这种算法需要先建立8x8的列联表，再分别 估计在零假设下，得出观测表的概率。使用马尔科 夫链的算法来估计列联表的概率。Ki、K$分别表示 位点1、位点2的等位基因数目。针对在单倍型 数据未知的情况,Slatkin和Excoffier #$提出以最 大似然估计的方法检验连锁不平衡。先用期望最 大化/代(expectation maximization , EM);法估计 单倍型频率，再用最大似然法估计得出单倍型频 率是否显著偏离随机模型，等同于等位基因间是 否显著地连锁

11、不平衡。在Genepop软件日;使用 Raymond和Rousset的算法,而Arliquin软件如米 用了以上2种算法。教师在讲解时，不仅要说明连锁不平衡出现的 原理、统计连锁不平衡概率的原理,还要注意，由于 检验连锁不平衡过程;对每2个位点都进行了检 验，这就导致对同一数据集进行了数量较大的独立 检验,对检验的P值需要进行Bonferroni校正,从 而使得结果更加严谨。对于数据中出现连锁不平衡 的情况，需要酌情考虑去除连锁的位点或在下一分 析过程;，将连锁不平衡的情况考虑进去。3估计哑等位基因频率哑等位基因产生的主要原因是微卫星侧翼序 列的变异引起PCR失败。当微卫星侧翼序列出现 突变(

12、插入或缺失),特别是引物结合位点出现突 变时,在PCR过程中,引物与DNA链的结合失 败，则会导致该位点无法正常扩增而出现哑等位 基因#9,冬芭。在PCR过程;，如果杂合子其中一个 等位基因没能被成功扩增，则该杂合子就会被记 成纯合子。哑等位基因的存在损害了对种群遗传 信息估计的准确性#峋。哑等位基因频率的估计方法有很多域。1992 年,Charkraborty等#2R$首次提出，在RLFP分析中, 可用哑等位基因来解释一些观测杂合子不足的现 象(heterozygote deficiencies )。Charkraborty 等 弓 I 入 哑等位基因频率r。根据期望杂合度(H)和观测 杂合

13、度(Ho)建立了计算哑等位基因频率的 公式r= HFH 这种方法有一个缺点就是没有考He+H虑缺失值 , 因为缺失值的产生可能是哑等位基因 的纯合子导致的PCR失败，而非人为的原因。 Brookfield站$在Charkraborty等的方法的基础上，将 缺失值当做哑等位基因纯合子，提出新的计算 方法r= HH 当观测杂合度和期望杂合度的值He+1都较大时,这2种方法得出的结果相差不大,但是 如果杂合度水平较低时,2种算法得出的哑等 位基因频率r差别就会比较大网。Brookfield和 Charkraborty等的算法都是假设种群处于哈温平 衡，但事实上很多种群由于近交或亚种群结构等 原因偏离

14、哈温平衡 Oosterhout等或针对偏离哈温 平衡的种群，提出了基于近交系数(inbreeding coefficients , FIS)或种群分化系数(fixation indices , Fst)计算哑等位基因频率的方法。同时，如果检验 发现纯合子出现的概率显著高于期望值，并且在各 个等位基因上均匀分布，则MICRO-CHECKER会 提示有哑等位基因存在#29$此外,Genepop软件商 中计算哑等位基因的方法是基于 Broofield 的算法, 运用期望最大化迭代法估计哑等位基因频率的最 大似然值 CERVUS软件#3。$使用似然/代法#31$,哑 等位基因的纯合子在计算开始不予考虑

15、，而是在之 后的优化中才考虑这种方法可避免将人为造成 的数据缺失认定为哑等位基因在具体实验中出现哑等位基因时，要进一步 分辨导致哑等位基因频率过高的原因近年来有 些学者认为，哑等位基因频率过高也可能是种群 本身的特点引起的#9,32$ Dabrowski等#33$在评估了 1 200个种群的哑等位基因检测之后发现，大约 78%的评估都存在假阳性评估哑等位基因的; 法通常都默认种群处于哈温平衡或已知种群的近 交水平(Fis)和种群分化程度(Fst)然而,在实际 实验;，很难达到这个假设所以很多杂合子缺失 的情况 ，可能并不是由哑等位基因引起的 ， 而是种 群再细分引起的瓦伦效应(Wahlund