植物水通道蛋白PIPs亚细胞定位转运的研究进展

1、植物水通道蛋白PIPs亚细胞定位转运的研究进展摘要 水通道蛋白是一种水分选择性跨膜运输的特异性孔道，介导水分子和小的不带电荷的溶质进行快速的 跨膜运输。植物细胞可以调节水通道蛋白基因的表达、蛋白的翻译后修饰以及蛋白的亚细胞定位,通过多种方式 调节细胞的水分运输能力从而响应逆境信号。定位在细胞质膜的水通道蛋白亚家族PIPs是植物水通道蛋白最大 的亚家族成员，对维持植物水分状态起着重要作用。本文重点介绍了 PIPs蛋白的亚细胞定位、胞吞和胞吐循环以 及蛋白质降解的调控机制。关键词 水通道蛋白；亚细胞定位；胞吐；胞吞自从1920年发现磷脂双分子层以来，水分的吸 收和在亚细胞区室间的转运被认为是通过自

2、由扩 散的方式穿透脂质双分子层。然而,哺乳动物的分 泌途径和植物的气孔开度调节需要快速的水分运 输，简单的扩散方式不足以解释这些生理过程。为 了解释这些过程,Johnsen等在1953年提出水分是 通过特定的孔隙来进行跨膜运输。随后,Agre等 在1988年分离纯化红细胞膜上的Rh血型抗原时， 发现了一种分子量为28 kDa疏水性跨膜蛋白，并将 此蛋白命名为CHIP28，该蛋白是细胞膜上转运水 分的特异性通道蛋白。1993年，Maurel等通过在非 洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞中表达拟南芥液泡 膜内在蛋白(-TIP1; 1)并验证其功能，首次证实植 物中存在水通道蛋白。199

3、7年人类基因组命名 委员会将CHIP28蛋白正式命名为Aquaporin-l (AQP1)。水通道蛋白能促进水分子的快速跨膜运输，还 可以运输少量离子和小分子溶质，从而调节植物细 胞渗透势，是细胞功能正常发挥不可或缺的。此 外,近年来的研究还发现，水通道蛋白通过与其他 蛋白的相互作用，调控植物对环境的应答。Zhang 等研究发现，缺水条件下RhPIP2; 1的丝氨酸残基 发生磷酸化修饰,诱导质膜上的MYB类转录因子 RhPTM进入细胞核，降低了碳水化合物合成相关基 因的表达，最终导致植株生长缓慢甚至进入休眠状 态。由此可见，PIPs不仅是水分跨膜运输的通 道，也可作为快速响应水分胁迫信号的调节

4、蛋白， 在抗逆调控机理中发挥功能。1植物水通道蛋白1.1植物水通道蛋白的分类水通道蛋白属于高度保守的膜蛋白超家族，这 类蛋白称为主要内在蛋白(major intrinsic proteins, MIPs)目前,在细菌、酵母、原生动物、古细菌、昆 虫、哺乳动物和植物中已鉴定出超过800个MIPs。 水通道蛋白不仅能够促进水分、&。2以及不带电的 小的溶质分子进行被动扩散，还可运输甘油、尿 素、NH3和活性氧等而。AQPs对。2的转运是动 植物发生免疫反应的重要信号。研究发现,植物对 细菌病原体丁香假单胞菌的免疫力以及脱落酸触 发的气孔关闭都需要AQPs转运足。?。根据底 物特异性、蛋白质序列同源

5、性以及亚细胞定位，植 物中的水通道蛋白分为7类，包括质膜内在蛋白 (plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)、液泡膜 内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins, TIPs) % 类 NOD26 膜内 在蛋白(NOD26-1ike intrinsic proteins, NOD26, NIPs)、小的碱性膜内在蛋白(small basic intrinsic proteins, SIPs) % 类 GlpF 膜内在蛋白质 (GlpF-like intrinsic proteins , GIPs)、混合膜内在蛋 白(hybrid

6、intrinsic proteins, HIPs)和未分类的 X 膜 内在蛋白(uncategorized X intrinsic proteins, XIPs)。PIPs可以根据C端和N端的序列特征进一步分 为不同的亚型，例如，高等植物的水通道蛋白PIPs被 划分为PIP1&PIP2和PIP3 %与PIP1相比,PIP2具有 较短的N端结构域和较长的C端结构域以及胞外的 A环。植物中的水通道蛋白多样性高于动物。例如， 在哺乳动物中仅有13种AQPs，而在拟南芥 (Arabidopsis thaliana)、毛果杨(Populus trichocarpa)、 大豆.(Glycine max)和

7、陆地棉(Gossypium hirsutum)中 分别有35、55、66和71个成员在拟南芥和玉米 (Zea mays)中均发现了 13种不同的PIP亚型,PIP1 有 5 种(PIP1； 1-PIP1； 5)，PIP2 有 8 种(PIP2； 1-PIP2； 8);水稻(Oryza sativa)中有11种不同的PIP亚型， PIP1 有 3 种(PIP1； 1IP1； 3)，PIP2 有 8 种(PIP2； 1- PIP2; 8)，水通道蛋白几乎分布在植物的所有器 官中。1.2植物水通道蛋白的结构水通道蛋白是一种小而高度疏水的膜整合蛋 白，其单体蛋白分子量在2334kDa左右，具有高度 保

8、守的氨基酸序列。AQPs的典型特征包括六个%- 跨膜螺旋(TM-1TM-6)，五个亲水环(Loop A- E)，N-末端的 AEF ( Ala-Glu-Phe)或 AEFXXT 基 序问。高度保守的B环和E环上各带有天冬酰胺 -脯氨酸-丙氨酸结构域(NPA motifs: asparagine- proline-alanine，NPAs)NPA 盒。关于水通道蛋白的三维拓扑模型(图1)，目前被人们广泛接受的 是“沙漏模型”，含有NPA结构域的B环和E环折 向磷脂双分子层，同时水通道蛋白对称的两半部分 相对角度为180。两个NPA盒在磷脂双层中间 形成了一个亲水通道，仅能容纳单个水分子通过。 N

9、PA盒一侧的由H2和H5的2个残基和E环上的 残基组成芳香族/精氨酸(aromatic/arginine, Ar/R) 区域能够对底物进行过滤筛选。保守的NPA盒有 助于水分子的选择性，NPA盒在植物PIPs和TIPs 中都高度保守，而在NIP或SIP中仅发现替代基 序询。每个水通道蛋白单体可以作为一个独立运 输水分的功能单位，但大部分水通道蛋白在生物膜 上以四聚体形式存在，少数以单体或二聚体形式存 在。可以是同型水通道蛋白形成同源四聚体，也可 以是异型水通道蛋白形成异源四聚体。通过亲和 层析纯化证明，在非洲爪蟾卵母细胞中共表达 ZmPIP1； 2和ZmPIP2； 5 ,在其形成的异源四聚体中

10、 可以检测到同源二聚体和异源二聚体。参考 ：oPIP2； 1的晶体结构，利用软件模拟了 ZmPIP1； 2 和ZmPIP2； 5形成的异源四聚体，通过生物计量和 结构模拟等方法发现，在PIP2； 5和PIP1； 2中分 别存在5个和6个肯能与蛋白异源作用相关氨基 酸残基。进一步的点突变功能验证结果显示， ZmPIP1； 2跨膜结构域5中的Phe220Ala突变，可 以激活ZmPIP1 ； 2的水通道活性，同时抑制同一异 源四聚体中的ZmPIP2； 5的活性心。由此可见， 水通道蛋白聚合体的形成和功能调控机制非常 复杂。1.3水通道蛋白功能的调控水通道蛋白的功能调控存在多种模式,包括转 录调控、

11、翻译后修饰。在缺水条件下，某些PIPs基 因的表达上调以促进水的运输并维持正常的生理 活动，而其他一些PIPs基因的表达可能下调以降低 水分的渗透性，从而避免植物过多的水分流失。 Pou等研究发现，高盐胁迫下A-PIP2； 7的表达在转 录水平被快速抑制,导致A-PIP2； 7的mRNA水平显 著下调皿。在水稻中超表达4sPIP1； 1能够调节水 分运输，提高水稻的抗盐性。盐胁迫下,紫花苜 蓿(Medicago sativa) DsPIP2; 2的过表达提高了种子 萌发率、存活率、脯氨酸含量和抗氧化防御活性，降 低了细胞膜损伤和活性氧的积累的。通过qRT- PCR检测了丛枝菌根共生植物根系AQ

12、Ps的表达 量,在干旱条件下PtPIPs表达量下调，表明宿主植 物中菌根介导的耐旱性可能与AQPs转录水平的复 杂调控有关。以往大多数研究报道了磷酸化调 控水孔的门控机制，例如菠菜质膜内在蛋白 SoPIP2； 1的X射线晶体结构表明，SoPIP2； 1的氨 基端和羧基端存在磷酸化位点，磷酸化会破坏分子 间的作用力，使D环变得松弛而开启水孔开放的构 象倔。最新的研究表明，QvPIP2; 2中的Leu206参 与了细胞酸化引发的门控过程，其残基能够阻挡水 分运输邸。磷酸化不仅参与PIPs的转运，而且能 够控制质膜的靶向性。AtPIP2； 1靶向质膜需要 Ser283发生磷酸化20，在哺乳动物细胞中

13、发现 AQP2从囊泡转运到质膜的过程中也受到磷酸化的 影响。此外，胁迫条件下AtPIP2； 1的胞吞也受 到不同程度的影响。最近，越来越多的研究揭示亚 细胞转运在调节AQPs功能和植物水分运输方面发 挥了重要作用。IntracellularCOOHEExtracellularIntracellularExtracellularnhIntracellularCOOHEExtracellularIntracellularExtracellularnh2- I 、COOH图1水通道蛋白的结构和“沙漏模型”的示意图(根据参考文献11修改)Fig.1 Schematic diagram of an AQ

14、P and the Hourglass model (modified according to reference 11 ).2植物PIPs蛋白的亚细胞转运2.1植物PIPs蛋白的胞吐胞吐途径是蛋白“顺行”方向转运的主要路径 (图2),新合成的蛋白质靶向内质网膜再流向到高 尔基体，随后依次流向质膜或细胞外基质% %PIPs定位到质膜并发挥功能的胞吐途径需要 多种元件的协助在玉米和拟南芥中，定点突变的 结果揭示PIP2s依靠其内部序列基序定向转运到质 膜次进一步的研究揭示，位于PIP2s氨基末端尾 部的双酸性元件与COPII分选途径相互作用并严格 控制PIP2s从内质网的输出邸随后，从内质网输

15、 出的蛋白经过高尔基体并依靠突触融合蛋白的作 用使PIPs靶向质膜2.1.1 PIPs从内质网到高尔基体的转运过程图2 PIPs在细胞内的转运途径Fig.2 Transport pathway of plasma membrane intrinsic proteins ( PIPs) within the cell.新合成的PIPs蛋白通过共翻译转运途径插入 内质网腔中，错误折叠的蛋白质将被重新折叠或标 记进行降解 PIPs作为非内质网驻留蛋白，会积累 在ER膜的特定区域中，该聚集区域也被称为内质 网输出位点(ER export sites，ERESs) 24_25 % 之后， COPII的组

16、分介导ER输出的囊泡出芽过程。前人 在酵母和动植物细胞中的研究表明蛋白中的双酸 性元件(Diacidic motifs或D/ExD/E)是蛋白质由 ER输出的信号26 %在玉米中表达#;PIP2； 4和 #；PIP2； 5时，可以观察到它们定位于质膜然而, 将它们的双酸性元件DIE突变后，这两种蛋白质会 驻留在内质网上22。此后，研究人员将%-PIP2; 1 的DVE双酸性元件突变后,-PIP2； 1也驻留在内质 网而不能正确定位到质膜药由此可见，PIPs转 运到质膜的过程中会需要双酸性元件。但是，进一 步的研究显示它们并不是调节这个过程的唯一元 素。将含有die双酸性元件的#;PIP2； 5

17、的N-末 端部分与#；PIP1; 2融合后发现#;PIP1; 2没有定 位到质膜上，表明#；PIP1; 2可能存在较强的内质 网驻留信号次。此外,#；PIP2； 1能够正确的定位 到质膜上,但它不包含任何双酸性元件，推测可能 有其他的内质网输出信号;#；PIP1s的N端存在多 个双酸性元件(EED、DKD或EKD图2 PIPs在细胞内的转运途径Fig.2 Transport pathway of plasma membrane intrinsic proteins ( PIPs) within the cell.PIPs向质膜的转运也涉及到其他的结构域，例 如,#；PIP1； 2和#；PIP2

18、； 5的TM3结构域内氨基 酸残基的定点突变结果显示，#；PIP2; 5的Leu127 和Ala131残基是蛋白在胞吐途径中的顺行运输所 必需的;进一步的研究发现，PIP2s的TM3结构域中 存在一个高度保守的基序LxxxA，能够调控蛋白从 ER中输出，这些研究揭示了 TM3结构域是影响 #;PIPs向质膜定位的关键区域27 %2.1. 2 PIPs从TGN到质膜上的转运过程新合成的质膜蛋白通常在高尔基体和反面高 尔基体管网结构(Trans-Golgi network，TGN)内加工 后运到质膜在玉米叶肉原生质体中观察到高尔 基体标记蛋白ST-mYFP和mCFP-#；PIP2; 5的共定 位，

19、表明PIPs的运输经过了高尔基体同时, #；PIP2； 5还与TGN标记蛋白VTI12共定位，进一 步证明PIPs的亚细胞转运经过了反面高尔基体管 网结构削此外,PIPs向质膜的运输受到SNAREs (soluble &-ethylmaleimide- sensitive factor protein attachment protein receptor, SNAREs)复合体的调 控，/NAREs复合体可以介导内膜系统的膜泡与靶 膜融合纳 SNAREs复合体中的突触融合蛋白 SYP121是定位于质膜的可溶性N-乙基马来酰亚胺 -敏感因子结合蛋白受体，起到将膜结构融合的作 用 Bessere

20、r等利用亲和层析纯化、双分子荧光互 补和FRET等一系列实验证明了 #;PIP2; 5定位到 质膜需要与SYP121相互作用耶对拟南芥中水 通道蛋白的研究显示,%-PIP2; 7的转运与两个突触 融合蛋白有关，/YP61和SYP121发生特异性相互 作用形成一个SNAREs复合物，使-PIP2； 7定位到 质膜上E%鉴于SNAREs具有广泛的亚细胞定位,人们很 容易推断不同的SNAREs复合体可能在运输的不同 阶段调控水通道蛋白的转运 VAMP721和 VAMP722是两个密切相关的R-SNAREs,通过TGN 或早期内涵体区室参与质膜分泌运输在 vamp721vamp722 双突变体中，PI

21、P2; 1-GFP 在质膜 的定位受到严重破坏，而液泡膜水通道蛋白TIP1； 1- GFP的定位与野生型相比没有受到影响，由此可见 SNAREs复合体对不同水通道蛋白成员的调控机制 不同。虽然VAMP721或VAMP722是否与PIPs直 接相互作用仍有待确定,但已有研究显示其对PIPs 定位的调控并不需要二者之间发生物理互作E % 2.2植物PIPs蛋白的胞吞真核生物的内吞作用，也称胞吞作用，是指质 膜内陷将所摄取的物质进行包裹，逐渐形成小泡、 脂双层融合、断裂、脱离质膜进入细胞内的过程，是 细胞物质运输的逆行路径也可以作为回收机制即 2. 2.1 PIPs蛋白的胞吞方式植物中研究最为深入的

22、胞吞方式是由网格蛋 白包被膜泡(Clathrin-coated vesicles, CCVs)介导 的网格蛋白介导的胞吞需要接头复合物AP-2的 m2亚基与货物蛋白Yxx0胞吞基序间的相互作 用京所有PIPs的C末端都存在Yxx0基序，虽然 现有研究并未检测到PIPs的Yxx0基序与m2亚基 的直接相互作用，但使用Tyrphostin A23 (可以阻止 网格蛋白AP-2接头复合物的m2亚基与货物蛋白 Yxx0胞吞基序间的相互作用)处理时,-PIP2； 1的 胞吞被减弱在网格蛋白重链缺失的突变体中检 测PIP2; 1胞吞进一步证实,PIPs由网格蛋白介导 的途径进行胞吞同时，为深入研究在不同条

23、件 下PIP2； 1的胞吞途径，荧光互相关光谱技术 ( fluorescence cross-correlation spectroscopy，FCCS ) 被用来对蛋白之间的相互作用进行量化分析拘 有趣的是在高渗胁迫条件下,-PIP2； 1不仅通过网 格蛋白介导的途径胞吞，也会通过不依赖网格蛋白 的胞吞途径内化进入细胞，表明质膜蛋白进行胞吞 时可以有多条胞吞途径，这些胞吞途径的选择取决 于植物所面临的环境条件肉2. 2.2 PIPs蛋白胞吞后循环回膜PIPs胞吞进入细胞后可以与分选微管连接蛋 白(sorting nexin 1, SNX1)共定位，说明PIPs被分选 进入SNX1区室 SNX

24、1区室属于TGN和多泡体的 中间区域 TGN成熟的同时也会分泌囊泡，分泌 泡最终靶向质膜阮姬在TGN中发现的PIPs主要 通过分泌膜泡和CCVs直接循环到质膜或在SNX1 区室中转运，也可以运输到多泡体中进行循环利用 或降解布雷菲德菌素A ( Brefeldin A, BFA)是一种真 菌毒素，可抑制ARF-GEF(某些腺苷核糖基化因子 小GTP酶)，如GNOM,从而抑制再循环内涵体转运 至质膜的过程。因此JFA处理可以引发一些蛋白 的聚集，形成BFA body %用BFA处理拟南芥观察到 PIPs出现在BFA body中，表明PIPs的组成型循环 经由ARF-GEF介导的途径M %最近一项基

25、因筛查 发现一种新蛋白BEX5，可调节PIP从TGN到质膜 的运输与野生型相比，在beX5-l突变体中，经 BFA处理并洗脱后由PIP2； 1-GFP形成的BFA body 仍然存在，表明BEX5参与了 PIPs从TGN循环到质 膜的胞吐 %-PIP2; 1从质膜的组成型胞吞是由 网格蛋白介导的,而在盐胁迫条件下,tyrphostin A23 不能完全抑制PIPs的胞吞作用，但BFA仍会阻碍 胞吐作用心，说明胁迫条件下PIPs的胞吞存在多 条途径%2.2.3 PIPs蛋白的降解在干旱、盐碱和高温等恶劣环境下，陆生植物 自身的水分平衡调节是保证其正常生长的必要条 件植物为了应对环境的变化，通过改

26、变自身组织 中PIPs的表达和活性来调节水分平衡膜蛋白能 够通过被泛素化靶向蛋白酶体或自噬体途径被输 送到液泡进行降解皿研究发现环膜锚定E3泛素 连接酶RmalHl和-PIP2; 1发生相互作用 RmalHl定位在内质网膜中，能够抑制-PIP2; 1从 ER转运到质膜，导致泛素化的-PIP2； 1通过蛋白 酶体途径降解 Hachez等在拟南芥的研究中确 定了水通道蛋白降解和细胞内转运之间的一种非 常新颖的联系板。TSPO是一种富含色氨酸的转运 蛋白，它作为多应激调节器能够调控%-PIP2; 7的表 达量47 %通过BiFc实验证明-PIP2； 7与TSPO在 内质网和高尔基体发生相互作用随后利

27、用自 噬体途径将复合物定向到液泡降解，这一过程受到 脱落酸诱导板。因此,植物细胞在水分胁迫下可以 通过多种途径降解水通道蛋白，从而调节细胞膜的 渗透性3 PIPs蛋白的亚细胞定位用经典的激光共聚焦显微镜观察时，正常条件 下PIPs-GFP的荧光信号在质膜上是连续分布的;而 有些膜蛋白，例如钾离子通道蛋白KAT1会定位于 质膜的点状结构中耶利用荧光漂白后恢复技术 对-PIP2； 1的侧向迁移率进行分析，发现ER驻留 的-PIP2； 1突变体在ER膜上的侧向迁移率较高， 而质膜定位的野生型%-PIP2; 1在正常生长条件下 显示出相对低的侧向迁移率由。应用全内反射显 微术(total internal reflection fluorescence microscop