微生物的遗传变异和育种

1、关于微生物的遗传变异和育种第1页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三几个概念遗传(heredity)变异(variation)遗传型(genotype)表型(phenotype)饰变(modification)第2页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三第一节 遗传变异的物质基础 三个经典实验 转化实验噬菌体的感染实验病毒的拆开和重建实验第3页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三（一）转化实验实验材料：Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniae 的几种形态S型和R型第4页，共102页

2、，2022年，5月20日，15点6分，星期三转化实验第5页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三转化实验第6页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三第7页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三 从活的S菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质，荚膜多糖等），并对各组分进行转化试验第8页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三（二）噬菌体感染实验第9页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三 实验材料：E.coli 噬菌体第10页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三（三）病毒的拆开和重建实验(T

3、MV和HRV)第11页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三结 论核酸是负载遗传信息的真正物质基础第12页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三二、遗传物质在细胞中的存在方式(一) 细胞水平(二) 细胞核水平(三) 染色体水平(四) 核酸水平(五) 基因水平(六) 密码子水平(七) 核苷酸水平 核酸的七个水平第13页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三遗传物质 类型核基因组真核生物的原核生物的核外染色体真核生物的原核生物的细胞质基因线粒体叶绿体等共生生物2um质粒等F因子(F质粒)R因子(R质粒)Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒等有核

4、膜包裹的真核(DNA+组蛋白)无核膜包裹的核区(环状双链DNA)(二) 细胞核水平第14页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三原核生物的质粒1. 质粒的定义指游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子，即cccDNA(circular covalently closed DNA)。第15页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三2. 特点超螺旋结构；携带某些特殊功能的基因（核基因组上所缺少），如具有接合、产毒、抗药、固氮或降解环境毒物功能的基因；某些质粒可与核染色体发生整合或脱离 附加体；当用一些理化因素处理时，可使子代细

5、胞中的质粒消除，如丫啶类染料、丝裂霉素、紫外线或高温等因素；具有重组的功能 质粒与质粒间、质粒与染色体之间；有些质粒不表现任何功能 隐蔽性质粒；第16页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三3.质粒的种类 按其复制与核染色体的复制是否同步 严紧型质粒 (stringent replication plasmid) 松弛型复制控制质粒 (relaxed replication plasmid) 按其功能 接合性质粒：如F质粒 抗药性质粒：如R质粒 产细菌素的质粒：如Col质粒 具有生理功能的质粒：如固氮的mega质粒、降解质粒等 产毒质粒：如Ti质粒第17页，共102页，202

6、2年，5月20日，15点6分，星期三 4. 典型质粒简介 1）F质粒 ( F plasmid )是E.coli 等细菌决定性别并有转移功能的质粒。 第18页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三2）R质粒( R plasmid, resistance plasmid)第19页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三3）Col质粒 (col plasmid)大肠杆菌素 是一类由E.coli某些菌株所产生的细菌素，具有通过复制、转录、转译或能量代谢等方式而专一性地杀死它种肠道菌或同种其他菌株的能力，由Col质粒编码；第20页，共102页，2022年，5月20日，1

7、5点6分，星期三4）Ti质粒 (tumor inducing plasmid) Agrobacterium tumefaciens（根癌土壤杆菌）从一些双子叶植物的受伤根部侵入，最后在其中溶解，释放出Ti质粒，其上的T-DNA片段与植物细胞中的核染色体组发生整合，合成正常菌株所没有的冠瘿碱类，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。第21页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三致癌区冠婴碱合成区冠婴碱分解区Ti质粒接合转移区(tra)毒性区(vir)DNA复制区(rep)6个功能区：第22页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三 可遗传变异不可

8、遗传变异 -饰变基因突变染色体畸变生物的变异突变基因重组第23页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三第二节 基因突变和诱变育种一、基因突变（gene mutation） （一）定义 核酸上一对或几对碱基突然发生的可遗传的变化。第24页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三（二）基因突变的类型基因突变的类型有哪些？哪些突变型是选择性突变株？哪些是非选择性突变株？为什么？举例说明如何筛选抗性突变株？第25页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三突变株的表型选择性突变株非选择性突变株营养缺陷型抗性突变型条件致死突变型形态突变型抗原突变型产量突变

9、型第26页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三（三）突变率每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率；自发突变几率一般在10-610-9范围内；突变率为10-9的含义第27页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三抗性突变是最常见的突变类型；细菌产生抗药性的途径基因突变抗药性质粒的转移生理适应由基因突变引起的抗药性的原因？第28页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三两种观点：突变的性状与引起突变的原因间呈对应性 抗性突变株的产生是由环境因素诱发出来的，属定向变异；突变是自发产生的，与环境是否存在该物质无关。第29页，共102页，2022

10、年，5月20日，15点6分，星期三1.变量试验（fluctuation test）实验设计者美国的鲁里亚和德尔波留克根据统计学原理设计；时间：1943年实验材料：对T1噬菌体敏感的大肠杆菌实验目的验证突变的性状与引起突变的原因间有无直接对应关系实验过程第30页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三103/mL24-36h第31页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三如果突变的性状与引起突变的原因间呈对应性结果如何？如何解释得到的实验结果？噬菌体的作用？实验结果讨论第32页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三突变的发生在时间上是随机的第33

11、页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三2.涂布试验（Newcombe experiment）实验设计者1949年纽康布实验材料对T1噬菌体敏感的大肠杆菌采用固体平板培养实验过程第34页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三第35页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三突变率的计算接种时每一平皿的细胞数：5104培养5h后每一平皿的细胞数： 5104 212.3（5100）= 2.6 1086个平皿上共发现28个突变菌落突变率=突变的细胞数/增加的细胞总数 =28/ 6 （ 2.6 108 -5104）=1.810-8第36页，共102页，

12、2022年，5月20日，15点6分，星期三3.平板影印试验（replica plating）实验设计者1952年，美国的莱德伯格夫妇实验材料E.coli K12实验过程第37页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三Lederberg 的平板培养法第38页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三第39页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三（四）突变的特点不对应性自发性稀有性独立性诱变性稳定性可逆性第40页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三(五)基因突变及其机制突变诱变自发突变基因突变染色体畸变：缺失、添加、易位、倒位碱基

13、置换移码突变 转换颠换 缺失 添加第41页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三诱变剂：凡能显著提高突变频率的理化因子；1）碱基置换转换（transition）嘌呤被嘌呤所置换或嘧啶被嘧啶所置换颠换（transversion）嘌呤被嘧啶所置换或嘧啶被嘌呤所置换1.诱发突变第42页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三直接引起置换的诱变剂直接与核酸的碱基发生化学反应，体内或离体均有作用。如：亚硝酸、羟胺、和各种烷化剂；间接引起置换的诱变剂通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后引起的变化。如：碱基类似物；诱变剂种类第43页，共102页，2022年，5月20日，

14、15点6分，星期三2）移码突变 DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变； 诱变剂种类： 丫啶类染料（原黄素、丫啶黄、丫啶橙、-氨基丫啶等）和ICR类化合物；第44页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三3）染色体畸变某些强烈理化因子，如电离辐射（X射线等）和烷化剂、亚硝酸等引起DNA分子的大片段损伤；染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位；染色体数目的变化；第45页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三染色体的易位 转座DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体上另

15、一部位或其他染色体上某一部位的现象。转座(因)子IS 插入序列(insertion sequence)Tn 转座子(transposon)Mu 噬菌体(mutator phage)a ba ba b第46页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三2.自发突变 (spontaneous mutation)1、由背景辐射和环境因素引起；2、由微生物自身有害代谢物引起；3、由DNA复制过程中碱基配对错误引起等。第47页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三（六）紫外线对DNA的损伤及其修复胞嘧啶水合物胸腺嘧啶二聚体二氢胸腺嘧啶胸腺嘧啶-胞嘧啶二聚体第48页，共102

16、页，2022年，5月20日，15点6分，星期三1. 光复活作用PREA-AT=TPREA-AT=TA-AT-TPREUV可见光二聚体解离PRE光激活酶(photoreactivating enzyme)A-AT-T5353第49页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三A-AT-T5353A-AT=T5353A-AT=T5353OHPA-A5353OHPT=TA-AT-T5353UV酶I酶II酶III酶IV 2. 暗修复（切除修复）酶I核酸内切酶酶II核酸外切酶酶IIIDNA聚合酶酶IVDNA连接酶第50页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三（一）自发突变与

17、育种 从生产中育种 定向培育优良菌株（二）诱变育种二、突变与育种 指利用物理、化学等诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学试验或生产实践使用。第51页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三 诱变育种的基本环节 诱变育种的原则 突变株的筛选方法 产量突变株的筛选 抗药性突变株的筛选 营养缺陷型突变株的筛选第52页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三 春日霉素产生菌的孢子悬液 诱变 涂布平板 培养2天（ 29） 培养4-5天(29 )生物鉴定板上含供试菌种 培养

18、17-18小时 (29） 检查抑菌圈的大小保持合适的温、湿度产量突变株的筛选第53页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三抗药性突变株的筛选第54页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三营养缺陷型突变株的筛选(1)与筛选营养缺陷型有关的三类培养基基本培养基(minimal midium，MM) -完全培养基(complete medium,CM) +补充培养基(supplemental medium,SM) A（2）与营养缺陷型突变有关的菌体野生型 (wild type) 能在-中生长营养缺陷型 (auxotroph) 能在+或A生长原养型 (prototr

19、oph) 能在-中生长第55页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三抗生素法菌丝过滤法青霉素法制霉菌素法原菌株(出发菌株)诱变剂处理淘汰野生型检出缺陷型鉴定缺陷型同一培养皿夹层培养法限量补充培养法不同培养皿逐个检出法影印接种法生长谱法营养缺陷型突变株的筛选方法第56页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三营养缺陷型突变株的筛选方法夹层培养法第57页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三影印接种法营养缺陷型突变株的筛选方法abc-+第58页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三(4)营养缺陷型的筛选举例枯草杆菌氨基酸缺陷型菌

20、体前培养氨基酸缺陷型菌株的营养要求的鉴定细胞悬浮液制备诱变处理中间培养淘汰野生型营养缺陷型菌株的检出（使细胞处于对数生长期）（UV照射60s）（调整细胞浓度为108个/ml）（30度CM中振荡过夜培养）（青霉素法）（生长谱法）营养缺陷型突变株的筛选方法第59页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三 无菌水洗下离心清洗后配成菌悬液（107-108/ml）0.1ml.+上生长的营 养缺陷型 培养营养缺陷型的鉴定生长谱法第60页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三作为研究代谢途径和基因重组等遗传规律的标记菌种；作为氨基酸、维生素或碱基等物质生物测定的试验菌种；用

21、作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株；营养缺陷型突变株的应用第61页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三 Ames test测定潜在化学治癌物 理论依据一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是DNA，所以任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。生物化学统一性法则生物的“三致”（致突变、致畸变、致癌变）物质可引起核酸结构的改变，从而引起其功能的改变；反之亦然。基本原理Salmonella typhimurium 的his-菌株在-的平板上不能生长，如发生回复突变，则能生长。第62页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三试验步骤：可疑“三致”

22、试样 + 鼠肝匀浆 S.t his- -吸入滤纸片保温 S.t his+ - 阳性 阴性 培养第63页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三1、某突变菌株在基本培养基上无法生长，而在添加了0.1%碱水解酵母核酸后，该菌株能生长。请设计一实验方案以进一步确定该菌株的生长必需物。2、什么叫做营养缺陷型菌株?在实验室中如何从原养型菌株获得营养缺陷型菌株?请设计一个具体实验方案。3、怎样用实验证明突变是自发产生的，而不是受环境诱导产生的？作业题第64页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三第三节 基因重组(gene recombination)第65页，共102页，

23、2022年，5月20日，15点6分，星期三基因重组的定义两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程称为基因重组或遗传重组，简称重组。重组和杂交的关系重组是在核酸分子水平上的杂交，与细胞水平上的杂交有明显区别杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。第66页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三一、原核生物的基因重组（一）转化（transformation）1. 定义：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。形成的杂种后代称为转化子。2. 能进行转化的微生物种类Streptococcus pneumoniae ；

24、Bacillus ；Rhizobium ；Pseudomonas； Staphylococcus； Saccharomyces cerevisiae； Neurospora crassa； Aspergillus niger等。但肠道菌科的细菌如E.coli等很难进行转化。第67页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三3.影响菌株间发生转化的因素与它们在进化过程中的亲缘关系有关；最易与细胞表面结合的是dsDNA；发生转化的细胞必须处于感受态;转化的频率低（0.1-1%，最高为20%）;转化需要的DNA浓度极低;4.感受态（competence）指受体细胞最易接受外源DNA片段

25、并能实现转化的一种生理状态。不同菌种感受态细胞所占比例、出现的时间和维持时间不同外界环境因子如环腺苷酸（cAMP）和Ca2+等可提高受体细胞的感受态水平。调节感受态的是一类特异蛋白感受态因子第68页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三dsDNA供体（strR）感受态受体（strS）同源区段配对单链整合，形成一小段杂合DNA区段转化子（strR）非转化子（strS）复制与分离5.转化过程第69页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三6.转染 (transfection)用提纯的病毒核酸（DNA或RNA）去感染其宿主细胞，可增殖出一群正常病毒后代的现象称为转染

26、。第70页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三1.定义通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。获得的重组细胞称为转导子。2.转导的种类普遍转导局限转导（二）转导 (transduction)第71页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三 通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何DNA小片段的“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象；一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介；可分为完全普遍转导和流产普遍转导；普遍转导 (generalized transduction)第

27、72页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三完全普遍转导( generalized transduction)供体受体第73页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三（2）流产普遍转导外源DNA片段不与受体细胞核染色体组进行交换、整合和复制，仅表现稳定的转录、转译和性状表达，且每经过一次分裂，就受到一次“稀释”。第74页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象；特点：只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因；该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体

28、携带；缺陷噬菌体的形成方式是在脱离宿主核染色体过程中，发生低频率（-10-5）的误切；需要通过UV等因素对溶源菌的诱导；分为低频转导和高频转导局限转导(restricted transduction)第75页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三 gal dgal1) 低频转导（LFT）部分缺陷噬菌体以大肠杆菌噬菌体为例 gal bio正常切割不正常切割biodbio 其频率为10-410-6 （LFT裂解物）E.coli K12gal - 少数 稳定的 gal+转导子低m.o.i.第76页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三2) 高频转导（HFT）双重溶

29、源菌（double lysogen）同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的受体菌； 被紫外线等诱导时，正常的 噬菌体具有补偿缺陷噬菌体（如 dgal）所缺失的部分基因的功能，使两种噬菌体同时获得复制；存在于双重溶源菌的正常噬菌体被称作助体噬菌体；双重溶源菌产生的裂解物中含有等量的和 dgal粒子HFT裂解物 低m.o.i. Ecoli. K12gal- 高频地把它转化成 稳定的 gal+转导子； 高m.o.i. 的LFT裂解物 感染 Ecoli. K12gal- ?第77页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三低频转导和高频转导的异同点相同点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因

30、由部分缺陷的温和噬菌体携带不同点低频转导：在裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例极低，称为低频转导裂解物。用其感染宿主，只获得极少量的局限转导子高频转导：产生高频转导裂解物，用其感染宿主，可获得较多的转导子。第78页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主基因上，而使后者获得了除免疫性以外新性状的现象，称溶源转变。溶源转变第79页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三（三）接合（conjugation）供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把F质粒或其携带的核基因组传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的

31、现象。能进行结合的微生物种类主要在细菌和放线菌中存在；研究得最清楚的是E.coli；E.coli有性别分化，决定性别的是一种质粒，即F因子是属于附加体的质粒。根据F因子在细胞内的存在方式，将E.coli分为四种类型： 第80页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三F+ 菌株含有游离的F因子，在细胞表面还有性菌毛 F-菌株不含F因子 ，细胞表面没有性菌毛。Hfr（高频重组）菌株F因子整合在核染色体组特定位点上F菌株Hfr菌株内的F因子因不正常切离而脱离核染色体组时形成的游离的但携带一小段核染色体基因的特殊F因子 初生的F菌株大肠杆菌的四种类型第81页，共102页，2022年，5

32、月20日，15点6分，星期三F质粒的4种存在方式及相互关系第82页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三大肠杆菌的接合方式F+ F- F+ + F+ Hfr F- Hfr + F- （多数情况下）Hfr F- Hfr + Hfr （少数情况下）F F- F+ FF因子转导以F质粒通过接合来传递供体基因的方式第83页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三第84页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三第85页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三中断实验第86页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三（四）原生

33、质体融合 (protoplast fusion)通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。此重组子称为融合子。能进行原生质体融合的细胞极其广泛原核生物、真核生物、高等动植物、人体第87页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三原生质体融合的主要步骤：1 选择亲本有特殊价值有选择性遗传标记2 获得原生质体脱壁酶去除细胞壁（细菌、放线菌、真菌）3 原生质体融合促融合剂PEG(聚乙二醇)或电脉冲4 筛选稳定的融合子第88页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三原生质体融合的主要步骤：各种融合子 长成菌落影印

34、接种-检出A+B+筛选优良性状的融合子筛 选+第89页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三原生质体融合的 特点1.重组频率高2.不受亲缘关系的影响3.能转移多数基因，可获得生产性状更为优良的新物种4.两个原生质体表面直接接触，对等融合形成（双向转移）第90页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三原生质体融合第91页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三二、真核微生物的基因重组基因重组的方式：有性杂交 、准性杂交、原生质体融合和遗传转化；（一）有性杂交 指不同遗传型的两性细胞之间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。举例酿酒酵母酒精酵母：产酒精率高但对葡萄糖的发酵力弱面包酵母：产酒精率低但对葡萄糖的发酵力强第92页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星期三比较项目双倍体单倍体细胞菌落液体培养在产孢培养基上大，椭圆形大，形态均一繁殖较快，细胞较分散会形成子囊小，球形小，形态变化多繁殖较慢，细胞常聚集成团不形成子囊S.cerevisiae的双倍体和单倍体的比较第93页，共102页，2022年，5月20日，15点6分，星