微生物下游加工工程课件

1、微生物发酵工程8.微生物下游加工工程 内容提要1.下游工程的流程2.发酵液的预处理和过滤3.产物的分离纯化方法Company Logo 产物在胞内还是胞外产物浓度产物的理化性质产物的用途产物的最低纯度标准发酵液中的杂质产物的市场价格选择下游工艺的原则8.1第一节 下游工程的流程Company Logo一. 下游工程的特点和重要性代价高，回收率低产物稳定性低杂质种类多含量高产物浓度低微生物工程产品特点 特 点提高回收率降低分离纯化成本下游加工研究的目的：Company Logo发酵液是复杂的多相体系，分离难；所占的成本比例高；决定产品质量的关键下游工程的重要性：Company Logo8.2发酵

2、液的预处理和过滤无论代谢产物是积累在胞内还是胞外， 都要首先进行预处理和过滤。一. 预处理: 加热稀释沉降絮凝预处理的方法目的：改变发酵液的性质加快沉降产物转移到便于处理的相中部分除杂Company Logo预处理的作用与方法色素高价阳离子杂蛋白交换吸附草酸-钙三聚磷酸钠黄血盐沉淀加热絮凝吸附Company LogoCompany LogoCompany LogoCompany Logo细胞破碎非机械法机械法高压匀浆X-press超声波法干燥冻融法渗透压冲击法酶解法化学溶胞Company Logo机械法-高压匀浆法 原理:利用高压使细胞悬液通过针形阀,由于突然减压和高速冲击撞击环,造成细胞破碎

3、Company Logo机械法-超声波法频率：15-25kHz原因：超声波的空穴作用。由于空穴泡又受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由此引起的粘滞性漩涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，造成细胞破碎。注意：温度上升。 杆菌比球菌容易，革兰氏阴性菌比阳性菌容易，酵母差。Company Logo非机械法-酶法原理：利用酶反应分解破碎细胞壁成分的特殊化学键，达到使细胞破碎的目的。优点：专一性强，条件温和缺点：成本高，易受条件影响。常用的酶有：溶菌酶，利用细胞的自溶：溶胞的酶是微生物自身产生的一种可以水解自身细胞壁上聚合结构的酶，以利生长过程继续进

4、行下去。 改变环境条件，可诱发这种酶过量产生或激发其他自溶酶。抑制细胞壁合成的物质也可以起到酶解的目的。Company Logo原理：将细胞先放到高渗透压的介质中，达到平衡后，介质被突然稀释，或将细胞转入到水或缓冲液中， 水会迅速进入细胞，使细胞膨胀，引起细胞壁的破裂。洗涤高渗低渗冷冻离心30mM Tris-HClpH 7.020% 蔗糖 pH 7.20.1mM EDTA4 大肠杆菌中亲水性的酶非机械法-渗透压冲击法Company Logo将细胞反复在低温下突然冷冻后，在室温下熔化，最后引起细胞破碎。非机械法-反复冻融Company Logo细胞破碎率的测定测定释放的胞内产物测定未破碎细胞量电

5、导率方法Company Logo8.3产物的分离纯化方法一. 沉淀法:等电点法非离子型多聚物法聚电解质法有机溶剂沉淀法盐析法沉淀法通过改变条件或加入某种溶剂, 使溶剂中的溶质由液相转变为固相析出的过程特点: 成本低,设备简单,收率高, 浓缩倍数高, 操作简单.Company Logo盐析的原理：中性盐的加入，能破坏蛋白质，酶等胶体性质，中和微粒上的电荷，促使蛋白质等沉淀。Company Logo用盐析分离蛋白质12在一定离子强度下，改变溶液的pH 及温度的沉淀法“K”分级盐析在一定的pH和温度下，改变离子强度或盐浓度的方法。“” 分级盐析法Company Logo 有机溶剂如丙酮，乙醇，甲醇等

6、能使溶于水的小分子生物物质及核酸，多糖，蛋白质等生物分子发生沉淀作用注意: 一般冷却加入同一溶剂，蛋白质的分子量越大，沉淀所需的有机溶剂量越少沉淀法 - 有机溶剂沉淀法Company Logo有机溶剂沉淀法优点分辨力高沉淀不需脱盐易固液分离易蒸发，无残留缺点蛋白易变性失活安全降温增收Company Logo有机溶剂的选择和使用浓度计算条件：与水互溶，但对蛋白质无作用乙醇，丙酮，甲醇，二甲基甲酰胺，二甲基桠砜，乙腈，氯仿，乙醚和2，戊二醇等是核酸，糖类，氨基酸和核苷酸最常用的异戊醇和二氧基乙醇Company Logo影响有机溶剂沉淀的因素：溶剂的种类和用量离子强度样品浓度分子量温度，时间Comp

7、any Logo原理：利用各种物质在不同的溶剂中具有不同的溶解度料液萃取剂萃取液萃余液二溶剂萃取法Company Logo在一定温度和压力下，溶质分配在两不相溶的溶剂中，达到平衡时，溶质在两相的浓度之比Company Logo化学稳定价廉安全与被萃液互溶度小黏度低，界面张力适中对产物有大的溶解度和良好的选择性溶剂的选择乙酸乙酯，乙酸丁酯，丁醇Company Logo影响因素带溶剂温度离子强度分配系数选择性能与所提取的生物物质形成复合物，而易溶于溶剂的物质Company Logo萃取方法：混合分离回收搅拌罐管道萃取喷射萃取单级萃取：效率不高多级萃取：错流：效果好用量大逆流：用量少收率高Compa

8、ny LogoCompany LogoCompany Logo三离子交换法特点用于前提树脂设备简单，操作方便，易自动控制，高效率生物物质的分离纯化，脱盐，浓缩，转化，中和脱色等某条件下，待分离样品能形成阴，阳或偶极离子人工合成的不容于酸，碱和有机溶剂的高分子聚合物Company Logo离子交换树脂阳离子交换树脂阴离子交换树脂强酸弱酸强碱弱碱Company Logo无使用限制再生处理，水洗至中性；处理，水洗至备用强酸性阳离子交换树脂Company Logo有以羧基（），酚羟基（）等为活性基团的弱酸性阳离子交换树脂，交换性能与溶液的值有关 再生水洗到，易再生成型弱酸性阳离子交换树脂：Compan

9、y Logo型型RN(CH3)3CL+NaOH RN(CH3)3OH + NaCl强碱性阴离子交换树脂：无使用限制Company Logo活性基团: 伯胺基,仲胺基,叔胺基和吡啶基.交换能力随pH值的变化而变化. pH越低,交换能力越大.RNH3OH + HCL RNH3CL + H2O再生易再生成羟型,耗碱量小弱碱性阴离子交换树脂:Company Logo12合成树脂时, 单体中二乙烯苯的含量百分数. 8-12%.一定量树脂中, 可交换基团的毫克当量数.。交换容量交联度Company Logo树脂的选择:产物的酸碱性质强酸性物质应选用弱减性阴离子交换树脂弱酸性物质应选用强碱性阴离子交换树脂便

10、于洗脱交联度大分子选用低交联度小分子选用高交联度但是在不影响交换容量的条件下, 尽可能提高交联度Company Logo交换条件pH: 被吸附物稳定; 被吸附物离子化; 树脂离子化树脂处理成一定型式,弱酸-钠型; 弱碱-氯型; 强酸强碱任何形式, 若产物在酸性和碱性条件下易破坏, 不能采用氢型和羟型.产物浓度; 低价离子增加浓度， 高价离子减少浓度洗脱条件酸性上柱,碱性洗脱; 碱性上柱, 酸性洗脱;缓冲液洗脱 操作条件:Company Logo四.结晶法物质从液态或气态形成晶体的过程许多性质相同的粒子在三维空间有规律地排列成格子状固体的物质物质自身的性质和适宜的条件晶体结晶能否结晶Company Logo生物物质形成晶体条件:样品的纯度溶液的饱和度溶剂的性质蛋白要50%以上稍或低过饱和不能与结晶物质发生化学反应应对结晶物质有较高的温度系数应对杂质有较大的溶解度安全,成本,易回收Company Logo 结晶的方法 浓缩冷却化学反应盐析含有样品的溶液减压蒸发浓缩, 使溶液达到过饱和适于溶解度随温度变化不大的物质先加热