微生物染色技术

1、微生物染色技术(一) 染色的基本原理微生物染色的基本原理是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。物理因素：如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素：根据细胞物质和染料的不同性质而发生的各种化学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附,且吸附作用稳固;同样,碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力,易于吸附。(二) 染料的种类和选择碱性染料：如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等；酸性染料：如伊红、酸性复红或刚果红等；中性染料：是上述两者的结合物,也叫复合染料,比如,伊红美蓝、伊红天青等。(三) 染色方法单染色法即只用一种染料对细菌着色。此法手续简便,但

2、一般只能显示菌体的形态,功能较单一。复染色法是使用两种及两种以上染料对细菌染色。常用的方法有革兰氏染色法和抗酸染色法等。(四)染色的基本程序单细胞细菌染色为例1.涂片：(1)在洁净无油脂的载玻片上滴一滴生理盐水(如果是液体菌悬液,则可不滴)。(2)用灭菌接种环挑取菌落少许至载玻片的生理盐水内,并轻轻涂布成薄薄的菌膜。若是菌液标本,则用无菌接种针直接涂布成菌膜。2.干燥：涂布的标本,一般在室温下自然干燥。 若需加速干燥，则可在酒精灯火焰上方利用其热空气加温,切忌火烤和温度过高。3.固定：细菌固定常用的是火焰加热法 将干燥涂片迅速通过火焰23次,温度不宜过高,以玻片背面触及皮肤有热感而不烫手为度。

3、4.染色：染色的目的是增大标本与环境的反差，便于在显微镜下观察。以普通涂片标本的染色为例,就是将所需染色液滴加在标本上，以覆盖涂膜为够，达到所需染色时间，倾去染色液，水洗，吸干即可。5.媒染：有的染色还需要增加媒染剂。以增大染料与被检标本物质的亲和力，或使染料更好地固定于被染标本。媒染剂可用于细菌标本固定之后，也可包含在固定剂或染色液中，革兰氏染色中的碘液就是媒染剂。6.脱色：使着色的染料脱去颜色称为脱色。能脱色的物质称为脱色剂。在染色中,使用脱色剂的作用有的是起溶媒作用,有的是影响细菌蛋白质的电离度，改变电荷的性质和数量，因而影响染料的染色质量。利用脱色剂主要是检查染料与细菌结合的稳定程度，

4、作为鉴定染色之用。如革兰氏染色使用乙醇，就是鉴别不同的细菌。使用脱色剂时，就是将脱色剂滴在经过染色的标本上，作用一定时间后，倾去脱色剂，水洗即成。有的脱色一定要掌握好时间，否则不能达到理想目的。7.复染：在进行鉴别染色时,已经进行过脱色的标本，常需要复染剂重复染色1次，使复染剂与初染颜色形成鲜明对比。复染不宜太强，以免覆盖初染颜色。常用的细菌染色法1. 简单染色法：简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便,适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色。简单染色方法:涂片干燥固定染色水洗干燥镜检简单染色流程(1)涂片：取一块干净的载玻片,并在其中央滴一小滴生

5、理盐水(或无菌蒸馏水)。接种环在酒精灯上杀菌后从斜面挑取少量菌种(金黄色葡萄球菌或枯草杆菌)与玻片上的水滴混匀后,涂布成一均匀的薄层。涂布面一般以直径1cm大小范围为宜。(2)干燥与固定：涂片最好在室温下使其自然干燥。亦可在酒精灯上微微加热,加速水分蒸发,但切勿过热。固定时,在酒精灯火焰外层尽快地来回通过23次,多为23s,以载玻片背面不觉烫手为宜,放置待冷后,进行染色。(3)染色：在涂片上滴染色液一滴,使染色液覆盖涂片,染色约1min。(4)水洗：斜置载玻片,在来自水龙头下用小股水线冲洗,直至洗下的水呈无色为止。(5)干燥：用吸水纸吸去涂片边缘的水珠,置室温下自然干燥或微微加热,以加快干燥速

6、度。注意用吸水纸时切勿将菌体擦掉。(6)镜检：用显微镜观察,并用铅笔绘出细菌形态图。2. 革兰氏染色法：革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。革兰氏染色是一种复染色法(由两种或多种染料染色的方法,称复染色法,又叫鉴别染色法)。革兰氏染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G表示。革兰氏染色需要的试剂主要有草酸铵结晶紫染液、碘液、石炭酸复红染液、95%乙醇、番红染液、香柏油、二甲苯。 染色流程：制片干燥固定初染水洗媒染水洗脱色水洗复染水洗干燥观察革兰

7、氏染色流程(1)制片。取大肠杆菌和枯草杆菌(均以无菌操作)分别做涂片。方法与简单染色法相同(取菌一定不要太多和涂片太厚,否则导致菌体重叠,难以观察)。(2)初染。用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。(3)媒染。滴加碘液媒染1min后水洗。(4)脱色。将载玻片上水滴小心吸净后,滴加95%乙醇脱色,至流出的乙醇不现紫色为止,需时2030s,随即水洗;或将乙醇滴满整个涂片,静置约30s,水洗,这样可节约乙醇。(5)复染。用番红染液复染约1.5min后水洗。(6)干燥。用吸水纸吸掉水滴,于室温下自然干燥。(7)镜检。待标本片干后置显微镜下,用油镜观察,注意细菌细胞的颜色,并用铅笔绘出细菌形态图。3. 芽

8、孢染色法细菌芽孢含水量很低,具有厚而致密的壁,其通透性比营养细胞低,着色和脱色均较困难,折光性很强。除了用着色力强的染料外,还必须加热,以促进芽孢的着色,再使菌体脱色,而芽孢上的染料则难以渗出,故仍保留原有颜色,然后用另一种反差强烈的染料复染,使菌体和芽孢呈现出不同的颜色,明显地衬托出芽孢来。具体方法有很多,如孔雀绿一番红染色法等。细菌芽孢染色流程(1)制备菌液： 加12滴无菌水于小试管中,用接种环从斜面上挑取23环苏云金杆菌或者枯草杆菌的菌体于试管中并充分打匀,制成浓稠的菌液。(2)加染色液： 加5%孔雀绿水溶液23滴于小试管中,用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。(3)加热： 将此试管浸于沸

9、水浴(烧杯),加热1520min。(4)涂片： 用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上,做成涂面,晾干。(5)固定： 将涂片通过酒精灯火焰3次。(6)脱色： 用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。(7)复染： 加番红水溶液染色5min后,倾去染色液,不用水洗,直接用吸水纸吸干。（8）镜检： 先低倍,再高倍,最后用油镜观察。结果：芽孢呈绿色,芽孢囊和菌体为红色。4. 鞭毛染色法细菌鞭毛极细,其直径般为1020nm,只有用电子显微镜才能观察到。但是若采用特殊染色方法,则在普通光学显微镜下也能看到。鞭毛染色法有很多,但基本原理相同,即在染色前先经媒染剂处理,让它沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然

10、后再进行染色。常用的媒染剂是由单宁酸和钾明矾或氯化铁等配制而成的一种不太稳定的胶体溶液,而染料可根据不同的方法有多种选择。5. 荚膜染色法荚膜是由多糖类衍生物和多肽聚集而成的,能溶于水,且自身含水量很高。由于荚膜与染料间的亲和力弱,不易着色,通常采用负染色法对荚膜染色,即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色。因此,荚膜在菌体周围呈现一个透明圈,从而可以清晰地观察到荚膜的大小和形态。荚膜染色法主要有番红染色法、湿墨水法、干墨水法和Tyler法等1. 负染色法(1)制片： 取洁净的载玻片一块,加蒸馏水一滴,取少量胶质芽孢杆菌的菌体放人水滴中混匀并涂布。(2)干燥： 将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹

11、干。(3)染色： 在涂面上加复红染色液染色23min。(4)水洗： 用水洗去复红染液。(5)干燥：。将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。(6)涂黑素： 在染色涂面左边加一小滴黑素,用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素,使黑素沿玻片边缘散开,然后向右一拖,使黑素在染色涂面上成为一薄层,并迅速风干。(7)镜检 先低倍镜、再高倍镜观察。结果：背影灰色,菌体红色,荚膜无色透明。2. 湿墨水法(1)制菌液： 加1滴墨水于洁净的载玻片上,挑少量胶质芽孢杆菌的菌体与其充分混合均匀。(2)加盖玻片： 放一清洁盖玻片于混合液上,然后在盖玻片上放一张滤纸,向下轻压,吸去多余的菌液。加盖玻片时不可有气泡,否则会影响观察。(3)镜检： 先用低倍镜、再用高倍镜观察。结果：背景灰色,菌体较暗,在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。3. 干墨水法(1)制菌液： 加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端,挑少量胶质芽孢杆菌的菌体与其充分混合,再加1滴墨水,充分混匀。（2）制片： 左手执玻片,右手另拿一边缘光滑的载玻片,将载玻片的一边与菌液接触,使菌液沿玻片接触处散开,然后以30角,迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端,使菌液铺成一薄膜。(3)干燥： 空气中自然干燥。(4)固定： 用甲醇浸没涂片,固定1min,立即倾去甲醇。(5)干燥： 在酒精灯上方,用文火干燥,不可使玻片发热。(6)染色