动物细胞工程918751228

1、植物物细胞工工程常用用的技术术有哪些些？2、植物物组织培培养的过过程？3、植物物组织培培养的理理论基础础？4、植物物体细胞胞杂交的的过程和和理论基基础？复习：动物细胞胞工程专题2细细胞工工程动物细胞胞培养动物细胞胞融合生产单克克隆抗体体动物细胞胞核移植植动物细胞胞工程常常用技术术动物细胞胞培养是是其他细细胞工程程技术的的基础思考与回回忆：1.动物物细胞全全能性特特点？随着细胞胞分化程程度的提提高而逐逐渐受到到限制，，分化潜潜能变窄窄。细胞胞核仍具具有全能能性。2.能否否用植物物组织培培养的方方法使动动物细胞胞发育成成动物个个体？不能。动动物细胞胞和组织织在体外外培养的的过程中中，伴随随一定的的组织分分化，不不管采用用什么手手段和培培养条件件，由于于细胞的的运动、、变化，，细胞发发生结构构功能变变异，结结果长时时间的培培养只能能使单一一类型的的细胞保保存下来来，最终终成了简简单的细细胞培养养。动物细胞胞培养和和本节内容容：一、动物物细胞培培养情境：在治疗烧烧伤病人人时，通通常采用用的方法法是取烧烧伤病人人的健康康皮肤进进行自体体移植。。但对一一个大面面积烧伤伤的病人人来说，，自身健健康皮肤肤有限，，使用他他人皮肤肤来源不不同，而而且会产产生排异异反应。。那么，，怎样能能获得大大量的自自体健康康皮肤呢呢？1.动物物细胞培培养的概概念：动物细胞胞培养就就是从动动物有机机体中取取出相关关的组织织,将它它分散成成单个细细胞,然然后,放放在适宜宜的培养养基中,让这些些细胞生生长和增增殖.思考：动物细胞胞培养的的目的是是什么？？与植物物组织培培养目的的相同吗吗？动物的细细胞培养养的理论论依据（（原理））？细胞增殖殖2.动物物细胞培培养的原原理：细细胞增殖殖定义：人们通常常将动物物组织消化后的初次培养养称为原代代培养。。胰蛋白酶酶处理取出组织织胚胎或幼幼龄动物物器官组组织剪碎单个细胞胞细胞悬液液转入培养养瓶内培培养（（贴壁生长长长成单层层细胞。。有接触抑制制现象）。①原代培养养3：过程程图示原代培养细胞悬液液CO2培养箱强调一：：细胞贴贴壁过程程■细胞贴壁壁：在培养瓶瓶悬液中中分散的的细胞很很快就贴贴附在瓶瓶壁上，，称为细细胞贴壁壁。■培养瓶或或培养皿皿壁要求求：表面光滑滑、无毒毒、易于于帖附。。■当贴壁细细胞分裂裂生长到到表面相相互接触触时,细细胞就会会停止分分裂增殖殖，这种种现象称称为细胞胞的接触触抑制。。强调二：：接触抑抑制定义：当原代培培养的细细胞处于于接触抑制制后,用胰蛋白酶酶处理,使细胞从从瓶壁上上脱离下来,然后加入入新的培培养液,将细胞分分离稀释释,并从原培养养瓶内转转接到新新的培养养瓶内,这个过过程称传代培养养.（分瓶培养养的过程程）②传代培培养▲细胞株：：传代细细胞一般般能传到到40-50代代，遗传物质质一般不不会发生生改变，叫细胞胞株。强调：细细胞系、、细胞株株▲细胞系：：传代50代以以后不能能再传下下去，部部分细胞胞遗传物质质发生了了改变，能连续续传代，，获得不不死性，，叫细胞胞系。细胞株和和细胞系系的区别别：细胞系的的遗传物物质改变变，具有有癌细胞胞的特点点，失去去接触抑抑制，容容易传代代培养。。3.总结结：动物物细胞培培养过程程动物胚胎胎或幼龄龄动物的的组织、、器官细胞悬浮浮液剪碎用胰胰蛋白酶酶处理10代细细胞转入培养养瓶40-50代细细胞传代培养养无限传代代单个细胞胞加培养液液稀释传代10代以内内，遗传物质质不改变变，保持持正常二二倍体核核型。传代10-50代左右右，增长长缓慢以以至于完完全停止止，部分细胞胞核型可可能发生生变化（遗传物物质可能能改变）为什么用用胰蛋白白酶处理理？原代培养养特点：：细胞贴壁壁、接触触抑制继续传代代培养少少部分细细胞获得不死死性，细胞突变变，遗传物质质已经改改变，等同于癌癌细胞。原代培养养4.动物物细胞培培养的条条件:1）无菌菌无毒的的环环境：适宜的温温度：人和哺乳乳动物细细胞最适适温度为为36.5±0.5℃℃。适宜的酸酸碱度：：PH：7.2-7.4液体合成成培养基基：（糖、氨基基酸）、、促生长长因子、、（无机机盐、微微量元素素）等；通常常还需加加入血浆、血血清等天然成分分。4）气体体环境：：2）营养养：3）温度度和pH：“95％％空气+5％CO2”的混合气气体培养养箱。氧气是细胞胞代谢必必须的；；CO2维持培养养液的PH。对培养液液和所有有培养用用具无菌处理理；培养液中中添加抗生生素防止培养养过程中中污染；；定期更换换培养液液以清除代代谢产物物，防止止对培养养细胞造造成危害害。主要有：：营养物质质（糖、、氨基酸酸、无机机盐、微微量元素素、促生生长因子子）动物血清清（10%～20%））等培养液（（液体培培养基））的成分分血清如：小牛牛血清等等血浆如：鸡血血浆等组织浸出出液可用鸡胚胚胎浸出出液,水解乳蛋蛋白由乳白蛋蛋白质经经水解得得到淡黄黄色粉末末,一般般可配制制成0.5%溶溶液。天然培养养基小资料根据细胞胞的生理理生化代代谢特点点,人工配制制而成,为为细胞提提供一个个近似体体内生存存环境,又便于于控制和和标准化化操作基本成分分各种碳水水化合物物(糖)、氨基基酸、维维生素、、无机盐盐、生长长因子、、激素等等常用培养养液几十种人工合成成培养基基小资料问题3：：为什么么用胰蛋蛋白酶处处理？问题1：：为什么么选用动动物胚胎胎或幼龄龄个体的的器官或或组织做做动物细细胞培养养材料？？因为其细细胞生命命力旺盛盛，分裂裂能力强强，分化化程度低低。问题2:为为什么么培养养前要要将组组织细细胞分分散成成单个个细胞胞？扩大细细胞与与培养养液的的接触触面积积，利利与细细胞吸吸收营营养。。动物组组织细细胞间间隙中中含有有一定定量的的弹性性纤维维等蛋蛋白质质，胰蛋白酶酶处理理动物物组织织，可可以使使动物物组织织细胞胞间的的蛋白白质和和细胞外外的其其他成成分酶酶解，，获得得单个个细胞胞。问题4：为为什么么用胰胰蛋白白酶处处理而而不用用胃蛋蛋白酶酶？动物细细胞培培养的的最适适PH值为为7.2-7.4，，胰蛋蛋白酶酶作用用的适适宜PH为为7.2-8.4，，胃蛋蛋白酶酶适宜宜PH为2.胃胃蛋白白酶在在PH为7.2-7.4的动动物细细胞培培养中中无活活性。。问题5：用用胰蛋蛋白酶酶处理理不会会把所所培养养的细细胞消消化掉掉吗？？控制好好时间间！长长时间间处理理当然然会损损伤细细胞。。问题6:动动物细细胞培培养液液的主主要成成分是是什么么？较较植物物组培培培养养基有有何独独特之之处？？问题7:动动物细细胞培培养能能否像像绿色色植物物组织织培养养那样样最终终培养养成新新个体体？主要成成分：：（葡葡萄糖糖、氨氨基酸酸）、、（水水、无无机盐盐）、、维生生素和和动物物血清清等。。独特特之处处有：：1、、液体体培养养基2、、成分分中有有动物物血清清等不能，，动物物细胞胞培养养只能能使细细胞数数目增增多，，不能能发育育成新新的动动物个个体问题8:动动物细细胞培培养的的原理理：细胞增增殖。。问题9:目目前使使用的的或冷冷冻保保存的的正常常细胞胞通常常在10代代以内内，为为什么么？10代代以内内的细细胞遗传物物质不不改变变，保保持正正常二二倍体体核型型。5.动动物细细胞培培养技技术的的应用用:1.蛋蛋白质质生物物制品品的生生产如病毒毒疫苗苗、干干扰素素、单单克隆隆抗体体2.应应用于于基因因工程程主要用用于作作为受受体细细胞3.检检测有有毒物物质，，判断断某种种物质质的毒毒性4.细细胞的的生理理、药药理、、病理理研究究如用于于筛选选抗癌癌药物物植物组组织培培养和和动物物细胞胞培养养的比比较：：比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖促--动物血清培养结果植物体细胞株、细胞系培养目的快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白取材植物幼嫩部分或花药胚胎或幼龄动物的器官或组织其他条件无菌无毒，适宜条件无菌无毒，适宜条件去核核注核核重组细细胞二、动动物体体细胞胞核移移植技技术和和克隆隆动物物1、概念：：动物核核移植植是将将动物物的一个细细胞的的细胞胞核,移入入一个个已经经去掉细细胞核核的卵卵母细细胞中中.使其其重组组并发发育成成一个个新的胚胚胎,这个个新的的胚胎胎最终终发育育为动物个个体.2、原理：：动物细细胞核核具有有全能能性比较以以下细细胞的的全能能性：：受精卵卵、二二分裂裂球的的子细细胞囊胚细细胞、、多能能造血血干细细胞单能造造血干干细胞胞、水螅的的消化化细胞胞、人人的消消化细细胞细胞具具有全全能性性多能细细胞单能细细胞高度分分化的的体细细胞3、分类：：胚胎核核移植植、体体细胞胞核移移植。。胚胎细细胞分分化程程度低低，恢恢复其其全能能性相相对容容易。。动物体体细胞胞分化化程度度高，，恢复复其全全能性性十分分困难难4、体体细胞胞核移移植过过程---示动动物克克隆---无性性繁殖殖1.））克隆隆羊多多利培培育过过程：：黑面绵羊去核卵母细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期重组胚胎胚胎移植另一头头绵羊羊的子子宫妊娠、出生克隆羊多利◆特别注注意：：克隆动动物性性状与与供体体动物物完全全一样样吗？？不可能能！因为：：一、供供体动动物只只提供供细胞胞核，，而细细胞质质中的的遗传传物质质（如如线粒粒体DNA）来来自于于受体体卵母母细胞胞.二、生生物的的性状状不仅仅与遗遗传物物质有有关，，还受受环境境的影影响。。供体受体代孕受体黑面绵羊去核卵母细胞白面绵羊乳腺细胞核a重组细胞电脉冲刺激早期重组胚胎b另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利1、写写出AB所所代表表细胞胞工程程名称称：a表示示：b表示示:2、实实施细细胞工工程时时，所所需受受体细细胞大大多采采用卵卵母细细胞的的原因因：体积大大，易易操作作。含含有促促使细细胞核核表达达全能能性的的物质质和营营养条条件。。3、多多利面面部毛毛色是是：根据遗遗传学学原理理说明明判断断依据据。4、若若黑面面绵羊羊的基基因型型为AA,白面面绵羊羊的基基因型型为aa，，则克克隆羊羊的基基因型型为核移植植胚胎移移植白色多利全全部的的核基基因都都来自自白面面绵羊羊aa◆取供体体细胞胞传代代培养养10代以以内的的细胞胞.为为什么么？◆用的是是去核核的减减数第第二次次分裂裂中期期细胞胞（MⅡ中期）为什什么？？◆激活方方法：：◆激活目目的：：◆促融方方法：：电刺刺激◆胚胎移移植至至代孕孕受体体内妊娠、、分娩娩2.））核移移植流流程供体：：优质质高产产奶牛牛受体：：普通通奶牛牛（卵卵母细细胞的的采集集与培培养））1.体体积大大，易易操作作。2.含含有促促使细细胞核核表达达全能能性的的物质质和营营养条条件。。有人说说它三三个母母亲，，对吗吗？核移植植流程程:1、供供体细细胞的的采集集与培培养5、用用物理理或化化学方方法激激活受受体细细胞，，使其其完成成减数数分裂裂进程程。6电刺刺激促促融使使供体体核进进入受受体卵卵母细细胞，，构建建重组组胚胎胎。4、将将供体体细胞胞注入入去核核卵母母细胞胞3、显显微操操作去去除卵卵母细细胞中中的核核2、受受体卵卵母细细胞的的采集集与体体外培培养7、胚胚胎移移植入入代孕孕母牛牛体内内8、妊妊娠分分娩与与供体体遗传传物质质基础础相同同的犊犊牛。。胚胎分分割：：受精卵卵二等分分四等分分把每等等份分分别移移植到到母体体子宫宫内，，迅速速繁殖殖出大大批性性状相相似的的个体体。动物的的基因因组中中，一一类基基因是是维持持生存存的，，在各各种细细胞中中都处处于活活动的的状态态。另另一类类基因因随着着组织织器官官和发发育阶阶段不不同而而选择择性表表达。。分化的的细胞胞内基基因的的活动动很不不完全全，因因此很很难像像受精精卵那那样发发挥细细胞全全能性性。胚胎细细胞克克隆比比高度度分化化的体体细胞胞克隆隆要容容易得得多。。动物难以克克隆的原因因5.体细胞胞核移植技技术的应用用前景6.体细胞胞核移植技技术存在的的问题看书P49-50页定义：指用自然或或人工方法法，使两个个或多个不不同的细胞胞融合成一一个细胞的的过程。不同基因型型的细胞之之间的融合合就是细胞杂交。。三、动物细细胞融合动物细胞融融合诱导融合的的因素：生物法：灭灭活的仙台台病毒诱导导融合。利用灭活仙仙台病毒是是动物细胞胞融合所特特有的。这是由于病病毒的磷脂脂外衣与动动物细胞的的膜十分相相似的缘故故。病毒外外壳上的某某些糖蛋白白可能还有有促进细胞胞融合的功功能。化学法：聚聚乙二醇诱诱导融合因为聚乙二二醇易得、、简便，且且融合效果果稳定，是是目前应用用最广泛的的方法。物理法：离心、振动动、电刺激激动物细胞融融合技术的的应用遗传学上：：基因定位位由于细胞杂杂交中染色色体容易丢丢失，因此此利用杂交交细胞检测测特定染色色体丢失与与特定基因因产物（蛋蛋白质）减减少的对应应关系，可可以进行基基因定位。。例如：人-鼠杂交细细胞通常丢丢失人的染染色体，可可以进行人人类基因的的定位（如如由于1号号染色体丢丢失导致尿尿苷单磷酸酸激酶活性性丧失，可可知该基因因位于1号号染色体上上）免疫学上：：利用杂交交瘤技术，，制备单克克隆抗体。。用途诱导方法细胞融合的方法植物细胞全能性细胞融合的原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物物细胞融合合的比较细胞膜的流流动性细胞膜的流流动性去除细胞壁壁后诱导原生质体体融合使细胞分散散后诱导细胞融融合物理（离心心、振动、电刺激）化学（聚乙乙二醇）物理、化学学方法（同左）灭活的病毒毒获得杂种植植株主要用于制制备单克隆抗体体回忆：1、抗体的的化学本质质？球蛋白2、抗体是是由何种细细胞产生的的？效应B细胞3、抗体主主要分布在在哪？血清4、抗原的的特异性取取决于什么么？抗原决定簇簇5、抗原决决定簇的种种类和数目目是否相同同？不同动物细胞融融合的成功功应用———单克隆抗体体的制备一种抗原只只能与相应应的抗体发发生特异性性结合。6、抗原与与抗体的关关系？一个抗原可可以与多个个抗体特异异结合4脾脏4种效应B细胞B1B2B3B4抗原B1B2B3B4Ab1Ab2Ab3Ab44种特异性性抗体问题情境1：长期以来，，人们为了了获得抗体体，采用的的就是把某某种抗原反反复注射到到动物体内内，然后从从动物血清清中分离出出所需抗体体的方法。。你认为这种种做法有什什么弊端？？产量低，而而且机体会会产生多种种抗体，抗抗体纯度低低，反应不不够灵敏，，这种情况况给临床医医学的诊断断与治疗带带来诸多不不便。问题情境2：每个浆细胞胞只分泌一一种特异性性抗体，要要想获得大大量专一性性抗体，你能利用前前面学习过过的动物细细胞工程的的有关技术术来解决问问题吗？（1）用单单个特定B淋巴细胞胞进行无性性繁殖，形形成大量的的细胞群体体，即克隆。（2）如此此克隆出的的B淋巴细细胞遗传特特性高度一一致，由它它们分泌的的抗体化学学性质单一一、特异性性强，叫做做单克隆抗体体。质疑：（动物细胞胞培养）在体外培养养条件下，，一个B淋淋巴细胞可可能无限增增殖吗？那么怎样才才能获得大大量单克隆隆抗体呢？？科勒米尔斯坦1984年年诺贝尔医医学和生理理学奖1975年年研究单克克隆抗体的的制备过程程获得成功功为什么先注注射特定抗抗原？特定抗原获得的B细细胞会是同同种的吗？？已免疫的B细胞细胞融合第一次筛选选（多种）杂交瘤细胞胞存活HAT培养养基筛选：：1、淋巴细细胞合成DNA有D和S两条条途径，其其中D途径径能够被氨氨基嘌呤阻阻断。但是是一般不分分裂增殖。。2、骨髓瘤瘤细胞是特特殊选择的的代谢缺陷陷型细胞，，其DNA合成过程程只具有D途径，能能被氨基嘌嘌呤阻断。。3、杂交瘤瘤细胞则既既可无限增增殖，又具具备DNA合成途径径。杂交瘤细胞胞（多种）细胞培养多孔培养板板第二次筛选选选出能产生生特定抗体的细胞群，，继续培养养。（专一抗体体检验阳性性细胞）克隆阳性细细胞体外培养单克隆抗体体单克隆抗体体从小鼠腹水水中提取1、单克隆隆抗体作为为诊断试剂,在临床生生化诊断、、病理组织织定位、体体内肿瘤的的定位等,与常规抗抗体相比,具有特异性强,灵敏度高高等特点.2、单克隆隆抗体上连连接抗癌药药物,治疗疗癌症等疾疾病(生物