单克隆抗体与基因工程抗体的制备

第四章单单克隆抗体体与基因工工程抗体的的制备第一节杂杂交瘤技术术的基本原原理一、杂交瘤瘤技术二、阳性杂杂交瘤细胞胞的克隆化化培养与冻冻存第二节单单克隆抗体体的制备一、单克隆隆抗体的产产生二、单克隆隆抗体的纯纯化三、单克隆隆抗体的性性质鉴定四、单克隆隆抗体的特特性第三节基基因工程抗抗体制备一、人源化化抗体二、小分子子抗体三、抗体融融合蛋白四、双特异异性抗体五、噬菌体体抗体库技技术第四节单单克隆抗体体的应用一、检验医医学诊断试试剂二、蛋白质质的提纯三、小分子子抗体的应应用四、抗体融融合蛋白的的应用五、双特异异抗体的应应用六、抗体库库技术的应应用和前景景思考题小结第一节杂杂交瘤技术术的基本原原理杂交瘤技术术原理：聚乙二醇（（PEG））：细胞融合剂剂，使免疫疫的小鼠脾脾细

胞与与小鼠骨髓髓瘤细胞融融合HAT培养养基的选择择培养：反复的免疫疫学检测筛筛选克隆化化增殖的杂杂交瘤细细胞系单克隆抗体体生成：接种杂交瘤瘤

细胞于于小鼠腹腔腔，腹水中中即可得到到高效价的的单克隆抗抗体抗体种类：：第一代抗体体多克隆抗体体（polyclonalantibody)第二代抗体体单克隆抗体体（monoclonalantibody)第三代抗体体基因工程抗抗体（geneticengineeringantibody)B淋巴细胞胞:寿命短,分分泌特异系系性抗体骨髓瘤细胞胞：寿命长杂交瘤细胞胞：寿命长，单单克隆抗体体流程一、杂交瘤瘤技术不产生Ig的重链链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴巴细胞的动动物品系相相同（一）小鼠鼠骨髓瘤细细胞动物：BALB/c小鼠7～12周周龄20g～25g体重重（二）免疫疫脾细胞细胞性抗原原：（1~2）×107/只，不加加佐剂，2~3周重复一一次可溶性抗原原：首次，完全全福氏佐剂剂+100微克抗原原，3~6周100~200微克克抗原，融融合前3天天，加强免免疫免疫小鼠。淋巴细胞。淋巴细胞发发育。浆细胞。抗原接种培养液：RPM1640培养养液DMEM培培养液（三）细胞胞融合细胞融合剂剂：PEG:分子量4000的PEG是是最常用用的细胞胞融合剂剂作用机理理：诱导细胞胞膜上脂脂类物质质结构重重排，使使细胞膜膜易打开开而有助助于细胞胞融合作用特点点：随机发生生的，不不同厂商商、批号号、分子子量的PEG，，其纯度度与毒性性有所不不同培养骨髓髓瘤细胞胞：选择对数数生长期期的细胞胞进行传传代培养养细胞形态态：浑圆圆、透亮亮、均一一、排列列整齐避免细胞胞返祖：：定期用用8-AG处理理细胞注意事项项：切忌忌过多传传代培养养，可将将细胞分分装冻存存于-80℃或或液氮及及干冰中中免疫脾细细胞的制制备：1×108的淋巴细胞胞无无菌手术术饲养细胞胞：细胞密度度过低不不利于细细胞生长长繁殖常用小鼠鼠腹腔细细胞作饲饲养细胞胞其中MQ还有清清除死亡亡细胞的的作用饲养存活活一般不不超过2周，不不影响杂杂交瘤细细胞的纯纯化。饲养细胞胞骨髓瘤细细胞与淋淋巴细胞胞(1:3)50%PEG1min内内加完;2min内加10ml培养液液融合方法法SP2/0细胞胞与脾细细胞的比比例为1：2～～51ml50%的PEG（无无菌，预预温37℃）在在1分钟钟内滴完完,静置置90秒秒,时间间一到,将事先先准备的的培养液液一滴一一滴加入入,停止止PEG作用根据细胞胞数量加加入HAT培养养基，使使之分加加到96孔板中中时每孔孔细胞数数为（0.5～～1.5）×105个。融合合后7天天，换用用HT培培养液细胞融合合10～20天出出现克隆隆HAT筛选挑克隆融合细胞胞的早期期培养HGPRT酶与TK酶：次黄嘌呤呤磷酸核核糖转化化酶胸腺嘧啶啶核苷激激酶（四）杂杂交瘤细细胞的选选择性培培养应用液：：8-杂氮氮鸟嘌呤呤聚聚乙二醇醇HAT培培养基：：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤呤A（Aminopterin）：氨基喋呤呤；叶酸酸拮抗物物，阻断断DNA合成主主要途径径T(Thymidine)：：胸腺嘧啶核核苷；““核苷酸酸前体””，供细细胞通过过替代途途径合成成DNAHAT选选择作用用：淋巴细胞胞：不能生长长，5~7天死亡亡；DNA合成成的主要要途径被被A阻断断骨髓瘤细细胞：不能生长长，5~7天死亡亡；HGPRT缺乏，，DNA合成的的替代途途径受阻阻SP2/O:HGPRT-，，TK-;长长命脾细胞:HGPRT+，，TK+;短命(7天)杂交瘤细细胞:HGPRT+，，TK+;长命骨髓瘤细细胞、脾脾细胞与与杂交瘤细细胞杂交瘤细细胞：长期生长长繁殖利用淋巴巴细胞的的HGPRT，，将H合合成为嘌嘌呤碱并并最终与与T一起起合成DNA从淋巴细细胞获得得产生某某种抗体体的遗传传信息从骨髓瘤瘤细胞获获得不断断繁殖的的能力有限稀释释法(limitingdilution)显微操作作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂平平板法(softagarmethod)二、阳性性杂交瘤瘤细胞的的克隆化化培养与与冻存特点：不需任何何特殊设设备克隆出现现效率高高实验室常常用方法法方法：细胞悬液液通过系系列稀释释每个培养养孔含0.5～～1个细细胞有限稀释释法效率最高高价格昂贵贵FACS配制方案案：杂交瘤细细胞（（（1～5）x106/ml)+细细胞冻冻存液(30%～40%牛牛血清，，50%～60%RPMI-1640培培养液，，10%DMSO)“慢冻””：分步冷冻冻，30℃→-70℃℃→液氮氮“快融””：取出立即即浸入37℃～40℃水水浴中，，使其迅迅速融化化、复苏苏杂交瘤细细胞的冻冻存与复复苏防止污染染避免染色色体丢失失防止非分分泌细胞胞的过度度生长防止细胞胞密度过过高而死死亡细胞冷冻冻的意义义第二节单单克隆隆抗体的的制备经过反复复克隆化化获得的的抗体阳阳性杂交交瘤细胞胞株应立立即扩大大培养（（除及时时冻存的的细胞外外）。因因多次传传代易引引起染色色体逐渐渐丢失而而使细胞胞产生抗抗体能力力逐渐减减弱甚至至消失，，还应尽尽早使用用获得的的抗体阳阳性杂交交瘤细胞胞株制备备单克隆隆抗体。。一、单克隆抗抗体的产生动物体内诱生生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，，（5～10）×105/只体外培养法：：中空纤维培养养系统单抗含量不高高，牛血清Ab难以去除除腹腔注射法前5天进行,预先腹腔注注射pristane（1～5）××106细胞1～3w形成腹水高滴度腹水可溶性抗原：：ELISA抗抗体捕获法细胞、亚细胞胞结构上的抗抗原：免疫荧光法（（用丙酮和甲甲醇按1:1比例固定细细胞）二、 单克隆隆抗体的纯化化ELISAELISA多头加样枪。免疫荧光法盐析沉淀亲和层析离子交换层析析McAb的纯纯化Ig类型、亚亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：：抗原类似物的的交叉反应效价测定：用腹水或培养养液的稀释度度表示表位测定：几株单抗是否否为不同表位位特异的,用用竞

争抑制制法，相加指指数法及微机机集群分析亲和性测定：：测定亲和常数数K杂交瘤细胞染染色体：秋水仙素裂解解法，小鼠B细胞染色体体40条，SP2/0细细胞68条，，杂交瘤细胞胞一般100多条McAb靶抗抗原分子量：：常用westernblot三、 单克隆隆抗体的性质质鉴定四、单克隆抗抗体的特性高度特异性高度的均一性性和可重复性性弱凝集反应和和不呈现沉淀淀反应对环境敏感性性（一）单克隆隆抗体的特性性优点：在体外“永久久”地存活并并传代用相对不纯的的抗原，获得得大量高度特特异的、均一一的抗体。适适用于以标记记抗体为特点点的免疫学分分析方法可用于体内的的放射免疫显显像和免疫导导向治疗（二）单克隆隆抗体的优点点与局限性局限性：固有的亲和性性和局限的生生物活性限制制了它的应用用范围反应强强度不如多克克隆抗体制备技术复杂杂、费时费工工、价格较高高McAbPcAb抗原要求可以不纯纯纯度高得量高低低特异性高低低稳定低高高沉淀反应无有有成本高低低McAb与PcAb的比较McAbandPcAb第三节基因因工程抗体制制备基因工程抗体体(Geneticengineeringantibody)根据研究者的的意图，采用用基因工程方方法，在基因因水平，对免免疫球蛋白基基因进行切割割、拼接或修修饰后导入受受体细胞进行行表达，产生生新型抗体。。主要包括嵌嵌合抗体、单单链抗体、人人源化抗体、、双价抗体和和双特异性抗抗体。将小鼠Ig基基因敲除，转转染人Ig基基因，在小鼠鼠体内产生人人Ab，再经经杂交瘤技术术，产生大量量完全人源化化抗体一、人源化抗抗体方法：从杂交瘤细胞胞分离出功能能性可变区基基因，与人Ig恒定区基基因连接，插插入适当表达达载体，转染染宿主细胞，，表达人-鼠鼠嵌合抗体特点：减少了鼠源性性抗体的免疫疫原性保留了亲本抗抗体特异性结结合抗原的能能力（一）嵌合抗抗体嵌合抗体定义：指利用基因工工程技术，将将人抗体可变变区（V）中中互补决定簇簇（CDR））序列改换成成鼠源单抗CDR序列。。重构成既具具有鼠源性单单抗的特异性性又保持抗体体亲和力的人人源化抗体。。RAb亦叫叫“重构型抗抗体”，因其其主要涉及CDR的“移移植”，又可可称为“CDR移植抗体体意义：多种特异的鼠鼠源单抗有可可能应用于临临床治疗（二）改型抗抗体Fab：抗原结合片断断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片片段SdAb：单区抗体二、小分子抗抗体小分子抗体其它生物活性性蛋白融合三、抗体融合合蛋白许多抗原抗体体反应要求双双价的抗原结结合位点，使使抗原分子上上的两个表位位交联或使两两个抗原分子子连接。将识识别肿瘤抗原原的抗体和识识别细胞毒性性免疫效应细细胞表面分子子的抗体连结结在一起，可可使效应细胞胞更容易与肿肿瘤细胞结合合识别，取得得杀伤肿瘤细细胞的作用。。四、双特异性性抗体分别分离纯化化两种不同的的McAb，，使各抗体解解离为单价抗抗体，再使两两种不同抗原原特异性的单单价抗体通过过化学试剂交交联起来，然然后分离出目目的组分。此此法缺点是容容易导致抗体体失去活性，，产物均一性性不佳。化学交联BsAb将两种分泌不不同特异性单单抗的杂交瘤瘤细胞进行再再次融合，产产生四源杂交交瘤(quadroma)。但二次杂交瘤瘤细胞株分泌泌的是两套重重链，轻链的的随机组合物物。BsAb在其中的比比例可为10%～50%不等。多倍倍杂交瘤细胞胞的稳定性差差，BsAb的产量少且且活性低，费费时费力，临临床应用时存存在人抗鼠抗抗体免疫反应应(HAMA)，因此此不适用于临临床。细胞工程BsAb多采用抗体分分子片段,如如Fab，Fv或ScFv,经基因因操作修饰后后,或体外组组装为BsAb,或直接接表达分泌型型的BsAb。基因工程BsAb定义：将体外克隆的的抗体基因片片段插入噬菌菌体载体，转转染工程细菌菌进行表达，，然后用抗原原筛选即可获获得特异的单单克隆噬菌体体抗体。利用用这一技术可可以得到完全全人源性的抗抗体，在HIV等病毒感感染和肿瘤的的诊断与治疗疗方面有其独独特的优越性性五、噬菌体抗抗体库技术用PCR扩增增人抗体重链链可变区(VH)和轻链链可变区(VL)基因克隆到噬菌体体载体并以融融合蛋白的形形式表达在其其外壳表面用抗原抗体反反应筛选出表表达所需要抗抗体的克隆并并扩增。使抗体基因以以分泌的方式式表达，获得得可溶性的抗抗体片段。抗体库：组合抗体文库库：在建库过过程中如果将将VH和VL随机组合人天然抗体库库：抗体mRNA来源于于未经免疫的的正常人（一）基本原原理和程序噬菌体抗体库库从外周血或脾脾、淋巴结等等组织中分离离B淋巴细胞胞，提取mRNA并逆转转录为cDNA；应用抗体轻链链和重链引物物，根据建库库的需要通过过PCR技术术扩增不同的的Ig基因片片段；构建噬菌体载载体。噬菌体体抗体库载体体有λ噬菌体体、丝状噬菌菌体和噬菌粒粒三种，其中中后二者是目目前构建表面面表达的噬菌菌体抗体库(surfacedisplayantibodylibrary)常用载载体；；表达载载体转转化细细菌，，构建建全套套抗体体库。。通过过多轮轮的抗抗原亲亲合吸吸附-洗脱脱-扩扩增，，最终终筛选选出抗抗原特特异的的抗体体克隆隆。构建噬噬菌体体抗体体库模拟天天然全全套抗抗体库库抗体文文库可可以达达到或或超过过1011库容容,能能包含含B细细胞全全部克克隆建库的的外源源基因因来自自人体体多克克隆细细胞的的总mRNA通用引引物具具有人人的种种属普普遍性性抗体的的VH和VL基基因的的随机机重组组也增增加了了抗体体的多多样性性（二））噬菌菌体抗抗体库库技术术的特特点避开了了人工工免疫疫和杂杂交瘤瘤技术术抗体库库的大大容量量抗体库库极高高的筛筛选效效率可获得得高亲亲和力力的人人源化化抗体体VH和和VL基因因的随随机重重组模模拟了了体内内抗体体亲和和力成成熟的的过程程所用的的抗体体基因因又来来自人人体第四节节单单克克隆抗抗体的的应用用检验医医学诊诊断试试剂蛋白质质的提提纯小分子子抗体体的应应用抗体融融合蛋蛋白的的应用用双特异异抗体体的应应用抗体库库技术术的应应用和和前景景病原微微生物物抗原原、抗抗体的的检测测肿瘤抗抗原的的检测测免疫细细胞及及其亚亚群的的的检检测激素测测定细胞因因子的的测定定一、检检验医医学诊诊断试试剂病原体体测定定：肝炎病病毒－－HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH－弓形虫虫,风风疹病病毒,巨细细胞病病毒，，单单纯疱疱疹病病毒细胞表表面CD测测定：：CD4/CD8:Th/Tc白血病病的分分型激素的的测定定：内分泌泌疾病病的诊诊断药物测测定(TDM)：：抗排斥斥药物物抗肿肿瘤药药物地地高辛辛研究工工作中中的探探针：：越来越越多未未知功功能cDNA的的克隆隆对复杂杂的基基因功功能和和多肽肽蛋白白功能能的研研究需需求增增加免疫沉沉淀二、蛋蛋白质质的提提纯单克隆隆抗体体是亲亲和层层析中中重要要的配配体。。将单单克隆隆抗体体吸附附在一一个惰惰性的的固相相基质质（如如Speharose2B、4B、、6B等））上，，并制制备成成层析析柱。。当样样品流流经层层析柱柱时，，待分分离的的抗原原可与与固相相的单单克隆隆抗体体发生生特异异性结结合，，其余余成分分不能能与之之结合合。将将层析析柱充充分洗洗脱后后，改改变洗洗脱液液的离离子强强度或或pH，欲欲分离离的抗抗原与与抗体体解离离，收收集洗洗脱液液便可可得到到欲纯纯化的的抗原原。MACS定义义：：分子子量量较较小小但但具具有有抗抗原原结结合合功功能能的的分分子子片片段段优点点：：分子子量量小小,穿穿透透性性强强,抗抗原原性性低低不含含Fc段段，，不不会会与与带带有有Fc段段受受体体的的细细胞胞结结合合，，不不良良反反应应少少可在在原原核核系系统统表表达达及及易易于于基基因因工工程程操操作作半衰期短短，有利利于及时时中和及及清除毒毒素三、小分分子抗体体的应用用应用：用于肿瘤瘤的导向向治疗肿瘤的影影像分布布基因治疗疗细胞内抗抗体：在细胞内内表达特异性识识别某一一基因产产物可干扰该该基因产产物的生生物活性性研究基因因结构与与功能的的关系肿瘤的体体内显像像诊断单链抗体体排除速速度快，，穿透力力强，在在肿瘤组组织中的的分布指指数较完完整抗体体分子高高放射显像像时，放放射性核核素排除除较快，，对身体体危害程程度小，，显像的的本底较较低理想的显显像定位位诊断载载体病毒的诊诊断和抗抗病毒感感染血液性疾疾病的诊诊断白血病的的免疫诊诊断及分分型四、抗体体融合蛋蛋白的应应用在体外免免疫检测测中的应应用自身红细细胞凝集集试验快速检测测HBV和HIV病原原体等避免化学学交联减减低两者者的活性性，从而而提高酶酶免疫检检测的敏敏感度用双特异异抗体作作为二抗抗，检测测限达1ng/ml五、双特特异抗体体的应用用在体内肿肿瘤放射射免疫显显像诊断断中的应应用方法：双特异抗抗体的一一只臂结结合靶抗抗原，一一只臂结结合半抗抗原螯合合剂，后后者可选选择性地地与放射射性核素素结合，，利用二二次导向向系统显显示特点：更高的的的灵敏度度和清晰晰度在体内免免疫治疗疗中的应应用抗体分子子可与放放射性核核素、细细胞毒药药物、毒毒素、等等多种分分子相融融合，这这些分子子在抗体体结合靶靶分子后后可提供供重要辅辅助功能能双功能抗抗体可有有效针对对低水平平的肿瘤瘤相关抗抗原，并并将细胞胞毒物质质输送到到肿瘤细细胞抗体还可可与携带带药物的的脂质体体、各种种PEG偶联，，从而增增强体内内运输和和药代动动力学六、抗体体库技术术的应用用和前景景在肿瘤体体外诊断断中的应应用在肿瘤诊诊断中的的应用在肿瘤治治疗中的的应用1．杂交交瘤技术术是如何何问世的的？其基基本原理理是什么么？2．什么么是单克克隆抗体体？其特