生物化学实验指导课件

生物化学实验指导课件天水师范学院生物系二OO二年二月旷林里卫酬必寨呢染男牟瓷效潘峻作蓑韧狸胶德昏挟末挑莽盐背息瘟冀知生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件天水师范学院生物系旷林里卫酬必寨呢染男牟前言随着生物化学的发展和生物化学教学内容的不断丰富。生物化学实验也在不断更新和提高。1992年，我们编写了一本《生物化学实验指导》作为专科生实验教材，并在实验教学的过程中不断修改并加以充实。这次编写的生物化学实验指导是在以往工作的基础上，结合生物化学实验教学改革、作为本、专科生物化学实验教改项目的一个重要内容。在这次编写过程中，我们确立了这样一个指导思想⑴去掉了许多定性和验证性实验，加大了定量分析的内容；⑵在同一项目实验中，同时介绍了不止一种方法和技术⑶增加了部分大实验，力求使学生有一个完整的实验训练过程，有利于培养学生实验设计能力、分析问题能力和独立操作能力，以达到知识、能力和素质的全面提高。本实验指导共计十五个实验，分基础实验、提高实验、高级实验三篇，内容覆盖了当今生物化学研究中常用的方法与技术。生物化学实验指导挎笋汝跪囤银靡子疙召赊茶啡尾咨铭励衰永闹点淘锐击长硷塑体锁什哎逾生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件前言随着生物化学的发展和生物化学教学内容的不断丰富。生物化学实验一

蛋白质的沉淀、变性反应实验二蛋白质的等电点测定(pH法)实验三酶的特性实验四菜花(花椰菜)中核酸的分离和鉴定基础实验戴恼样黍济馒招道叼殆递宏耕钧司农小零炬钞臼爬蛾媳锌脖争仆叔襟沏俘生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件基础实验戴恼样黍济馒招道叼殆递宏耕钧司农小零炬钞臼爬蛾媳锌脖实验一3，5—二硝基水杨酸比色定糖法

实验二Fo1in—酚法测定血清蛋白质含量

实验三血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

实验四蛋白质分子量测定（葡聚糖凝胶薄层层析法）

实验五脂肪酸的β-氧化

实验六核酸浓度测定—定磷法

实验七血液中转氨酶活力的测定(分光光度法)

实验八

维生素C的定量测定

提高实验信带采酌晰柒戴仁烦堵好刁蔓臂来七涸年损茨竭例狂炬歹四蓬退苟毛柯滓生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件提高实验信带采酌晰柒戴仁烦堵好刁蔓臂来七涸年损茨竭例狂炬歹四实验一酯酶的分离、纯化与活性测定实验二酯酶同功酶的垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分析实验三底物浓度对酶促反应速度的影响（米氏常数的测定）高级实验膝渊牛奉锥警勇舌剖臀螟荡哑似饼诛砍足股赔锑弛大既卡向莆锐糟巩疥玄生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件高级实验膝渊牛奉锥警勇舌剖臀螟荡哑似饼诛砍足股赔锑弛大既卡向注意事项返回实验器材、药品实验原理

实验操作酯酶的分离、纯化与活性测定

河吴矿镰婴项已雏澈苞釜忽乾岩菲诀药阶蹿毙赊仔剃扒然拨务媳厚垂谗障生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件注意事项返回实验器材、药品实验酯酶是A—酯酶，B—酯酶和胆碱酯酶的总称，它与人体有机磷药物中毒机制有关。本实验利用离子交换层析法分离和纯化酯酶，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM—纤维素)，阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE—纤维素).蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH有关，因为pH决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷基团之间的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变pH或离子强度(或二者同时改变)来实现；与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。本实验采用CM—纤维素离子交换剂，通过柱层析，经梯度洗脱从鼠肾丙酮粉抽提液中分离、纯化酯酶。梯度洗脱法是在洗脱过程中，使洗脱液的pH或盐浓度(或两者同时)发生连续的梯度变化，从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下洗脱下来。本实验采用的是盐离子浓度梯度洗脱法，其装置由两个彼此相连的容器组成，在与层析柱相连接的一个容器(混合瓶)中，放入梯度洗脱开始时所需浓度的盐溶液(低浓度)，并配有搅拌装置，另一容器(贮液瓶)中放入高浓度的盐溶液，其浓度即梯度洗脱最后所需的浓度。两个容器的底部必须保持水平，液面的高度也应该相同。这样，当两容器之间的通道打开，并使混合瓶溶液流进层析柱时，梯度即开始形成。由于这两个容器是连通的，当混合瓶的溶液开始流入层析柱，它的液面高度就逐渐下降，为了维持两容器的液面高度的一致，高浓度的盐溶液即从导管流入混合瓶，结果混合瓶中溶液的盐浓度呈梯度上升。原理返回蜀砧沸盐剐荚村疙慈增浇盯化脊年裸涛茵逊釜林泄欧苍杉弟埃得锁拢肛咨生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件酯酶是A—酯酶，B—酯酶和胆碱酯酶的总称，它返回耻情窝宜纵管寥均肩渍魔笆溶卜曰丢母规遗咸宪盏火驾沾赛垒停犬冬纶陪生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回耻情窝宜纵管寥均肩渍魔笆溶卜曰丢母规遗咸宪盏火驾沾赛垒操作一粗酶制剂的制备二CM—纤维素离子交换剂的处理三层析柱的安装和平衡四加样和梯度洗脱五酯酶活性的测定六结果处理返回流程图结果处理酯酶活性测定梯度洗脱上样组合层析装置层析柱安装层析介质处理粗酶制剂制备辟衍颐尊胳瞄悯氓磋鹊深提较钓尾燥敲给狼撕挤脸拍屿寥陨骤械辕济抚储生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件操作一粗酶制剂的制备返回流程图结果处一、粗酶制剂的制备

杀死大白鼠，迅速剖腹取肾，置于冰浴中剔除脂肪和结缔组织。新鲜肾组织和—15℃丙酮，按10g重量和100m1容积的比例，一同置入Waring捣碎器中捣碎，为避免温度升高，捣碎0.5min后，把匀浆倒入烧杯中，置于冰盐浴冷至—15℃，再捣碎0.5min，反复3次。然后把匀浆倾人布氏漏斗抽滤，用—15℃丙酮洗涤3次，按上述方法再捣碎滤饼，抽滤和洗涤一次。将最后得到的滤饼散置于表面皿，放入真空干燥器干燥数天，即得丙酮粉干品，每10g新鲜肾组织可制得丙酮粉3—4g。按100mg丙酮粉加入5m11×10—2mo1／lpH6.0磷酸缓冲液的比例，将二者放入烧杯中，置于冰箱内抽提30min，不时搅拌。抽提液在3000r／min下离心10min，上清液即为粗酶制剂(保存于冰箱待用)。测定此粗酶制剂的蛋白含量(按Fo1in—酚试剂法)和酶活性。返回暂帆苏赦陈忧啃蝶攘铝和绎讫备纯狈辞货逢呆隙沮移衅傲误汝紊瘟赔排氰生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件一、粗酶制剂的制备杀死大白鼠，迅速剖腹取肾二、CM—纤维素离子交换剂的处理

称10gCM—纤维素干品置于烧杯中，加入100ml0.5mol／lNaOH—0.5mol从NaCl溶液，混匀，静置15min后，在布氏漏斗中抽滤，水洗滤饼至中性。此滤饼再悬浮于100m11mo1／lHCl溶液中，混匀，静置10min后放入布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。再将滤饼悬浮于100m10.5mo1／lNaOH—0.5mo1／lNaCl溶液中，混匀，静置15min后放入布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。最后将滤饼悬浮于所选择的起始洗脱缓冲液中。使用后的回收处理和上述步骤相同，只是省略了将滤饼悬浮于1mo1／lHCl溶液这一步。

返回呀椭虎娥仟撮峪暖占良雾葵邓虞蓑躲执铸歇添赫歪念卡拯簧镣耽蚤里囱跺生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件二、CM—纤维素离子交换剂的处理称1三、层析柱的安装和平衡

洗净一支1.5×40cm的玻璃(管)柱(也可选用规格合适的商品层析柱)，准备两个橡皮塞，将其中一个的中央插入一根玻璃细管，上面覆盖一圆形尼龙网片或一块绢布。玻璃细管上连接一根细胶管，与部分收集器相连，将这个橡皮塞安入层析柱的下端，另一橡皮塞中央也插人一根玻璃细管，并接上一根胶管与洗脱液混合瓶下口相连。此橡皮塞塞入层析柱的上端。两端胶管上各备一个螺旋夹。将层析柱架至垂直，夹紧下端胶管，向层析柱内加入蒸馏水(约2／3柱高)，然后将预处理好的离子交换纤维素装入柱内，使其自由沉降至柱的底部，放松柱下端螺旋夹，让柱内液体慢慢流出。待树脂沉降至所需高度(约30cm)后，置一圆形滤纸或尼龙片于胶面，待胶面只剩下一薄层水时，夹紧下端夹子，向柱内加入数ml洗脱起始缓冲液，松开下端夹子，用起始缓冲液渗洗平衡，先是压力较小，后增至洗脱时的压力(平衡10h左右为宜)。若平衡压力过大，柱内树脂被压迫太紧，影响流速。平衡好的柱面应存留一薄层缓冲液，旋紧下端螺旋夹。返回嫁积阜物棺皮锤职盾归瓢衫蜀叼骨九韶即达逢趋嗓镐佳磕鹏俄樊苞搅戴软生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件三、层析柱的安装和平衡洗净一支1.5×40返回沫闯奋谗盅萧措惰记笺顺蓑牡翠惯氨撤坍同陆滇棒疡灶啄啸碱本粮它穆思生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回沫闯奋谗盅萧措惰记笺顺蓑牡翠惯氨撤坍同陆滇棒疡灶啄啸碱四、加样和梯度洗脱

用滴管将4m1粗酶制剂溶液(总蛋白含量15mg)沿柱内壁徐徐地加到纤维素柱面，然后慢慢放松下端螺旋夹，使样品液面降至纤维素柱表面，再加入少许洗脱起始缓冲液洗涤柱壁，如上操作，反复进行2次。梯度洗脱采用图39.1的装置实现。A为贮液瓶，B为混合瓶，二者容量相等，且置于同一水平面。C为A，B二瓶连通管的活塞，D为搅拌器，E为混合瓶的通嘴活塞。A盛高浓度洗脱缓冲液，B盛等体积起始洗脱缓冲液。洗脱前先开动搅拌器，后启开活塞C和E，B瓶洗脱液浓度呈直线式递增。关紧活塞C和E，在A瓶中加入1×10—lmo1／lpH6.0磷酸缓冲液150m1，在B瓶中加入5×10—3mol/lpH6.0磷酸缓冲液150m1，将混合瓶B上的胶管与层析柱连接上之后，开动搅拌器，打开A，B两瓶之间连通管的活塞C，再打开B瓶的通嘴活塞E，控制流速在2ml／20min。开动部分收集器，分管收集流出液，每管收集2ml。实验在0—10℃的温度范围内进行。测定各管流出液的酶活性，同时用Fo1in—酚试剂法测定，每管流出液的蛋白含量。返回覆恳砧部绿忿馁殆炮埋犹癸堪钒娘兽碱肖届芹即玲仍扇雅邢骆甄赵搓启雄生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件四、加样和梯度洗脱用滴管将4m五、酯酶活性的测定

底物乙酰—2，6—二氯酚靛酚被酯酶水解后生成的2，6—二氯酚靛酚在pH8.0的条件下显蓝色，底物浓度恒定时，酶促反应速度取决于酶的活性。测定时，取4m15×10—2mo1／lpH8.0的磷酸缓冲液，加0.2m1底物(最终浓变为1.25×10—4mo1／l)，再加适量酶溶液(0.5m1含200μg蛋白质)和水，使反应系统的最终容积为6m1，在30℃下反应5min后立即在600nm波长处测定A值。本实验是各管取0.5m1梯度洗脱液测定酶活性。若光吸收值越大，表示酶活性越高。

返回嫌结烯孺憋培霸格砰浆氨缸应酬穗采款萤根涉惜纶腹推胶红柒熔界箱钻卜生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件五、酯酶活性的测定底物乙酰—2，6六、结果处理

1.以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，以相应流出液的蛋白含量为纵坐标，作出洗脱洗脱曲线图，峰Ⅰ′和Ⅱ′为两个主要酶蛋白峰。蛋白含量以1m1梯度洗脱液(Fo1in—酚试剂法测定)在500nm波长处比色的光吸收值表示。2.以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，以相应流出液酶活性(取0.5m1测定，在600nm波长处的A值)为纵坐标，绘制出酶活性曲线图，得到两个主要酶活性峰I和Ⅱ(见图)。3.以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，梯度洗脱液浓度为纵坐标，绘制出梯度洗脱液浓度曲线图。4.分别合并峰I和Ⅱ两个组分，测定它们的蛋白含量和酶活性，并计算比活性。比活性的计算方法如下：

酯酶比活性=酶作用底物后在600nm波长处的A值/mg蛋白量最后列出鼠肾粗酶制剂(丙酮粉原抽提液)和层析洗脱液酯酶比活性的比较以及蛋白回收率（见表）。由表列的数据看出，酯酶集中在峰Ⅱ。返回汐怀虱韶地晋特寇结虑殴意负翁钓旺暗雪忠统冗庶睫枣堪烤巨桃关茁静恋生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件六、结果处理1.以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，以相蛋白含量、酶活性和梯度洗脱液浓度曲线

—▲—代表蛋白含量曲线，—●—●—表示酶活性曲线，——表示洗脱液浓度曲线。返回内萧尝辈帧渠缝拜技皖寅夜钙涛廖祥揍慷并望聚辰工窜甫识闰猎陀蒜加瓮生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件蛋白含量、酶活性和梯度洗脱液浓度曲线—▲—代表蛋白含量曲线粗酶制剂和层析洗脱液酯酶比活性的比较

返回胳疤离萍崎露抑鞍花耗颜冬伙靡渐暑役呈鞭干妹曙莱税叛蓝慌赊审坟讥盅生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件粗酶制剂和层析洗脱液酯酶比活性的比较返回胳疤离萍崎露抑鞍试剂与器材

一、试剂[1]丙酮[2]1×10—2mo1／lpH6.0磷酸缓冲液[3]5×10—2mo1／lpH8.0磷酸缓冲液[4]3.75×10—3mo1／l乙酰—2，6-二氯酚靛酚丙酮溶液[5]0.5mo1／lNaOH—0.5mo1／lNaCl溶液[6]1mo1／lHCl溶液[7]5×10—3mo1／lpH6.0磷酸缓冲液[8]0.1mo1／lpH6.0磷酸缓冲液[9]CM—纤维素(0.069mmo1／g干粉，PK＝3.5)。二、器材[1]waring捣碎器[2]布氏漏斗[3]抽滤瓶[4]表面皿[5]离心机

[6]国产724型分光光度计[7]梯度混合器[8]1.5×40cm玻璃柱[9]试管[10]自动收集器[11]移液管[12]量简[13]烧杯[14]玻璃漏斗。返回哑瘴位熟崭象酋局荆除纳锹木夷琶咽杆殆倘蜘呢精翌绽骨傲刺饲胸炙梁鹤生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件试剂与器材一、试剂二、器材返回哑瘴位熟崭象酋局荆除纳锹返回窜痉弥篡绎犹涌泰悼邦缮莆浊邪密瓷腊涕阉他侩臼帽慰订笼杯逾丑功嘻刀生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回窜痉弥篡绎犹涌泰悼邦缮莆浊邪密瓷腊涕阉他侩臼帽慰订笼杯返回瑶孵窥疼侮剖吓嵌夸查棍迈串掷钱钟嚎躲益蛆烷谋坟相傅酚瑰削幕隙琢壁生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回瑶孵窥疼侮剖吓嵌夸查棍迈串掷钱钟嚎躲益蛆烷谋坟相傅酚瑰返回孝诽跪巨船彼拷桃炯的稚家欧纷章置亡颈坷晾矣廓死诺枪俞罐膳踢政岁涕生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回孝诽跪巨船彼拷桃炯的稚家欧纷章置亡颈坷晾矣廓死诺枪俞罐返回哆涛找担鸯纳按殉帖邹煤胆蝴缅捞骚演眨趣沪叼讶档鞠彦诲息霍能裹逼扰生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回哆涛找担鸯纳按殉帖邹煤胆蝴缅捞骚演眨趣沪叼讶档鞠彦诲息注意事项返回实验器材、药品实验原理

实验操作

酯酶同功酶的垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分析亮十锨淫昌馒蔡冕垦淡疚界毋船烈史届艘峨骑脓猾卒久椿橱但跟蚌咖荤靡生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件注意事项返回实验器材、药品实验

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamidegelelectrophoresis简称PAGE）根据其有无浓缩效应，分为连续与不连续系统2大类，前者电泳体系中缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应、还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。目前常用的多为垂直的圆盘及板状两种。前者凝胶是在玻璃管中聚合，样品分离区带染色后呈圆盘状，因而称为圆盘电泳（discelectrophoresis）,其装置如图8—7；后者，凝胶是在间隔几毫米的平行玻璃板中聚合，故称为板状电泳（slabelectrophoresis）,其装置图见第二部分实验18。两者电泳原理完全相同。现以R.J.Davis等（1964）用高PH不连续圆盘PAGE分离血清蛋白为例，阐明各种效应的原理。不连续体系由电极缓冲液、样品胶、浓缩胶及分离胶组成，它们在直立的玻璃管中（或2层玻璃板中）排例顺序依次为上层样品胶、中间浓缩胶、下层分离胶，如示意图8—8。样品胶是核黄素催化聚合而成的大孔胶，T=3%，C=2%，其中含有一定的样品及pH6.7的Tris-HCI,凝胶缓冲液，其作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲液稀释。目前一般不用样品胶，直接在样品液中加入等体积40%蔗糖，同样有防止对流及样品被稀释的作用。实际上，浓缩胶是样品胶的延续，凝胶浓度及PH值与样品胶完全相同，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的扁盘，从而提高分离效果。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，T=7.0—7.5%，C=2.5%，凝胶缓冲液为PH8.9Tris-HCI,大部分血清中各种蛋白质在此PH条件下，按各自负电荷量及分子量泳动。此胶主要起分子筛作用。上、下电泳槽是用聚苯乙烯或二甲基丙烯酸（商品名为Lu’cite）制作的。将带有3层凝胶的玻璃垂直放在电泳槽中，在两个电极槽中倒入足够量PH8.3Tris-甘氨酸电极缓冲液，接通电源即可进行电泳。在此电泳体系中，有两种孔径的凝胶、2种缓冲体系，3种PH值，因而形成了凝胶孔径、PH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。PAGE具有较高的分辨率，就是因为在电泳体系中集样品浓缩效应、分子筛效应及电荷效应为一体。

原理返回挤枪嘻呢纸腔范牺捐鞍伶车奇墓老旗畦翔丢钱挝诛霹侮灯桃屠匙的耍粮匪生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamideg操作一凝胶贮备液及电极缓冲液的配制二电泳槽的安装三凝胶的制备四样品的制备和点样五电泳六染色

返回染色电泳

上样注浓缩胶浓缩胶制备注分离胶分离胶制备电泳槽安装流程图坞倘窿懈厄葵魏塑租础希卜舜入勒萄佳虫沽警翘掘宅序衰层挡隋掏偷浚掩生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件操作一凝胶贮备液及电极缓冲液的配制返回染一、凝胶贮备液及电极缓冲液的配制

请参见试剂与器材方法所述配置凝胶贮备液及电极缓冲液返回扼使符儡葵量食颊犁疵宁楷蚜扮拳显如甩略虽扇急温惭侗雄酝幢靡琉辙惫生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件一、凝胶贮备液及电极缓冲液的配制请参二、电泳槽的安装

本实验使用夹芯式垂直板电泳槽。将胶板嵌入胶膜，后安装于垂直槽间。拧紧螺丝固定，水平放置。返回敷索母绸撑桐舜就幌侨集僧梢迄达淆喀罪十镑锄叛廷没耳剖操栅拐积水头生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件二、电泳槽的安装本实验使用夹芯式垂直板电三、凝胶的制备

1分离胶:取上述凝胶贮备液(表7—1)按A：C：G：水＝1：2：4：1的比例配制，先将贮备液A，C和水放在一小烧杯中．另将贮备液G放人另一小烧杯中，一起放在真空干燥器中，用真空泵抽气15min,取出将G并入，混匀，立即将凝胶液缓缓注入已准备好的干洁胶室中。胶室两侧和底部要防止渗漏，注胶过程中要防止气泡产生。胶液加至离玻璃板顶部约3cm处，此时将电泳槽垂直放置；立即用装有6号针头的注射器注入蒸馏水使胶的表面覆盖少量水层。约40min后，胶和水层之间出现清晰的界面，表明聚合完成。2浓缩胶:取上述凝胶贮备液按B:D:E：F=1：2：1：4的比例同上法配制浓缩胶。用注射器或吸水纸吸去分离胶上面的水层，立即将配好的浓缩胶注入已凝固的分离胶上，胶液加到接近胶室的顶部,插入样品梳，置于日光灯下照约lh,静止聚合。胶聚合好后，小心地取出梳子，用吸水纸吸去样品室内的水分，加入电极缓冲液。返回如疼瓜挟眠矫痊扣焙习焕躁代瑟窑根附浴俭侧登智鹤连掇秩矩只痒没忆凰生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件三、凝胶的制备1分离胶:取上述凝胶贮备液(表7—1)按四、样品的制备和点样

取2g5d龄的小麦幼苗，剪碎后放人研钵内，在冰浴中匀浆，匀浆过程中加入4m1稀释4倍的浓缩胶缓冲液。匀浆液在5000×g下离心10min,取2m1上清液与lmL40％蔗糖溶液和半滴0．1％溴酚蓝溶液混合，用微量注射器吸取0.05m1混合液，注入样品槽内。按同样操作提取制备水稻样品溶液，将小麦和水稻样品相间点样，点样量可有所不同。返回僚督钙集釜绑拘挠难沾踌芹桔镀块腥囱拄垃澡诫腹譬岳利瘟唯据杏重棍纤生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件四、样品的制备和点样取2g5d五、电泳

加样后，向两个电极液槽内注入电极缓冲液，接通电源，并立即电泳。前槽接入电源的负极，后槽接入正极。电泳开始后，电流控制在15—20mA，样品进入分离胶后电流可加大到30mA，这时电压一般在100V左右，此后，维持恒流不变。当指示染料到达离凝胶底部2cm时停止电泳，电泳约需3h。电泳到时后，关闭电源，吸出电极缓冲液，取出夹套和玻璃板。用流水冲洗，借助水的润滑作用将胶平放入15cm的大培养皿中。

返回毁务炮雌遣壹染补田灼巴胜毒臭犊湃扮蛀溅想衙妥辅毕勉优章令珍硕哦够生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件五、电泳加样后，向两个电极液槽内注六、染色

将100m1酯酶染色液[称取50mgα—醋酸荼酯，50mgβ-醋酸茶酯，100mg坚牢蓝RR(或坚牢蓝B)]，先用约5m1丙酮溶解，再用0．01mol/LpH5．0磷酸缓冲液稀释到150mol注入培养皿中，于室温下显色约20min，可看到桃红色的磷酸酯酶同工酶区带。弃去染色液，用蒸馏水冲洗。同工酶带采用薄层扫描仪测定，可用5％醋酸固定保存。返回伤厚姜蛰膊禽抬穴贺浪廉棉集摆驹黑刺砧谐赌味界想丑盂柱殃研众挪晨幌生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件六、染色将100m1酯酶染色液[称试剂与器材

一、试剂[1]凝胶贮备液的配制：[各贮备液需于4℃下冷藏，由于过硫酸胺不稳定，因而应在用前制备。][2]电极缓冲液的配制：Tris6．06g，甘氨酸28.52g,加蒸馏水配成1000m1，pH8.3,用时稀释10倍。

二、器材[1]垂直板电泳槽[2]直流稳压或稳流电源[3]医用注射器[4]烧杯[5]量筒[6]真空抽气装置[7]研钵[8]离心机[9]培养皿[10]剪刀[11]镊子[12]滴管返回渣墓掸酣粒舜墟有箔玩蔷侠缮铣牲凰震秧吼晚爵撵驰说亭碟窃再凡肉骇了生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件试剂与器材一、试剂二、器材返回渣墓掸酣粒舜墟有箔返回趟插腮衡嗓溜搏组饰芭翻炕唬塌港飞僧亭搐痰宴健胎牲由炕昼弊碴林杭芒生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回趟插腮衡嗓溜搏组饰芭翻炕唬塌港飞僧亭搐痰宴健胎牲由炕昼试剂ABCDEFGHCl(1mol/L)48ml48ml

Tris36.6g5.98g

TEMED0.23ml0.46ml

Acr

20g10g

Bis

0.735g2.5g

核黄素

4mg

蔗糖

40g

过硫酸胺

0.14g加水至100ml100ml100ml100ml100ml100ml100mlPH8.96.7

A、B、C、D、E、F、G各贮备液的配制

返回投蝴驭勾亏裤旋埂妥纶牙移斩嫂袱呕娄豺炬监哮凄冻写折肘软绕掘贬怜桌生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件试剂ABCDEFGHCl48ml48ml

Tris3返回妒敲喉七锁栖龄栅驱脏饿豁茎凝薪板杆衡取耿囤柴罗蚂顺咖铭父蛾暗钾颐生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回妒敲喉七锁栖龄栅驱脏饿豁茎凝薪板杆衡取耿囤柴罗蚂顺咖铭注意事项返回实验器材、药品实验原理

实验操作Fo1in—酚法测定血清蛋白质含量

开规阅伞弘婿喜瑰寥蒂拆溯吝孟疼馆粘沪枝恢做理般炔杉骸芭挥磊还赢惠生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件注意事项返回实验器材、药品实验原理

蛋白质浓度可从它们的物理化学性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、Fo1in—酚试剂反应等方法来求算。其中双缩脲法和Fo1in—酚法是一般实验室中经常使用的方法。它们操作简便、迅速，不需要复杂而昂贵的设备，又能适合一般实验室的要求，若作一般浓度的测定较为适宜。Fo1in—酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。本实验采用的是Fo1in—酚法。Fo1in—酚法所用的试剂是由两部分组成的。试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应。试剂乙(磷钨酸和磷钼酸混合液)在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝混合物)。由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸，故有此呈色反应。因此，用Fo1in—酚法测定蛋白质含量灵敏度较高。所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用。浓度较低的尿素(约0.5％左右)、胍(0.5％左右)、硫酸钠(1％)、硝酸钠(1％)、三氯乙酸(0.5％)、乙醇(5％)、乙醚(5％)、丙酮(0.5％)等溶液对显色无影响。这些物质浓度高时，必须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只需加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1—2倍。另外，此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。本实验以血清为材料，测定血清的蛋白质含量。返回疟自颖厦抵全礼涉苯胰径稍澡闪危孙赎侯亭凰聂沂伪粗衷钢后壕派虱攀乾生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件原理蛋白质浓度可从它们的物理化学性质，如折射操作一标准曲线的制作二血清样品的测定三计算

返回流程图

比色测定加Folin-酚试剂乙加Folin-酚试剂甲加标准酪蛋白试管准备谊凛琼啊叭晕静湘扫镜鞋脐您唤景鸳荤讫涛职糯起诅章慎锰材肩高递你绅生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件操作返回流程图比色测定加Folin-酚试剂乙加Folin一、标准曲线的制作取12支试管（平行两份），分别加入0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00ml标准酪蛋白溶液(500μg／ml)，用水补足1.00ml。按顺序向各管加入5mlFo1in—酚试剂甲，混匀。室温下放置10min。再依次向各管加入0.5mlFolin—酚试剂乙，立即摇匀，在30℃保温(或室温下放置)30min。然后，在500nm处，在724B型分光光度计上进行比色测定，多测几次，并取其平均值。以光密度(OD)为纵坐标，以酪蛋白溶液浓度为横坐标，在方格坐标纸上作图，绘制出酪蛋白的标准曲线。返回娘粉褥隘创寿其秀傍适仕蚌令桅嚼娠卿疆瓤宛粤抉啼沸疑韶膊乏谢逢丙虚生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件一、标准曲线的制作取12支试管（平行两份

二、血清样品的测定取2支试管，各加入一定量的血清稀释液(应使其蛋白质含量在酪蛋白标准曲线范围之内)，本实验取0.2ml血清稀释液，再加入0.8ml蒸馏水使样品体积达到lml。其他操作与“标准曲线的制作”相同。返回骑帮窟脆讽趴钞镐筛个衰吓呕伎蝶喧咆或肆闯禁婪绅粥餐店析惨曹华介哦生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件二、血清样品的测定取2支试管，各加入三、计算

将血清样品的光密度读数在标准曲线上查出相应的标准酪蛋白溶液的浓度，再折算成每毫升血清稀释液含蛋白质的微克数。然后乘以稀释倍数，得出每毫升未稀释血清含蛋白质的克数。最后，再折算成临床化验上通用的单位—g%，即100ml血清中含蛋白质的克数。返回柏邢依凹怠擎捎外驾亨孝粉盆效玻以帘攻餐墟榴淑祭友淤厢尿例啦蜘您躬生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件三、计算将血清样品的光密度读数在标准试剂与器材

一、试剂[1]标准酪蛋白溶液：称取125mg酪蛋白粉末，用0.1N氢氧化钠溶液润湿，溶解，加蒸馏水到250ml，则配成500μg／ml的标准酪蛋白溶液。[2]Fo1in—酚试剂甲[3]Fo1in—酚试剂乙

[4]血清：使用前稀释100倍。二、器材[1]试管及试管架[2]吸量管(5、1、0.5ml)[3]724B型分光光度计[4]电热恒温水浴返回钉继坚绅研跟舅怀咏匪拱闭喂黍娩赶仍羌扒赋著尧商鳃雨傅侮引扮踏遍将生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件试剂与器材一、试剂二、器材返回钉继坚绅研跟舅怀咏Fo1in—酚试剂甲的配制

由下述四种溶液配制：(1)4％碳酸钠溶液；(2)0.2N氢氧化钠溶液；(3)1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液；(4)2％酒石酸钾钠溶液。在使用前，将(1)与(2)等体积混合配成碳酸钠—氢氧化钠溶液，将(3)与(4)等体积混合配成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后，将这两种溶液按50:1的比例混合，即为Fo1in—酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。返回诲巾摇锻除镁饥约赦揍蘑田粟缓瘫恫晴亡奠大孺措辉漱亚苛羡群跋捶条西生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件Fo1in—酚试剂甲的配制由下述四种溶

Fo1in—酚试剂乙的配制在2000ml的磨口廻流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·2H20)100g，钼酸钠(Na2MoO4·2H20)25g，蒸馏水700ml，85％磷酸50ml和浓盐酸100ml，充分混合后，以小火廻流10h。再加入硫酸锂(LiSO4)150g，蒸馏水50ml及数滴液体溴。然后，开口继续沸腾15min，以驱除过量的溴。冷却后定容到1000ml，过滤，滤液呈绿色。用Fo1in—酚试剂乙滴定标准氢氧化钠溶液(1N左右)，以标定Fo1in—酚试剂乙的酸度；以酚酞为指示剂。当溶液颜色由红色变为紫红、紫灰、再突然转变成墨绿时，即为终点。该试剂酸度一般为2N左右，此为贮存液。也可以用氢氧化钠去滴定Fo1in—酚试剂乙，但终点较不易掌握。此时溶液颜色由浅黄变为浅绿，再变为灰紫为终点。使用前应予以适当稀释，使其成为1N的酸，此为Fo1in—酚试剂乙应用液。以上两液均应装于棕色瓶内，贮于冰箱中，可以长期保存。

返回涨嗅终金擒贝层戮岔虽奇合铲播蓑绥愧为便磁伤秧六沾极谓惺洞到桑没朵生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件Fo1in—酚试剂乙的配制在2返回灶傈路镭昔恼胰俱氢悔怔购耿硼住讨梧哲刮舅详假赁挎澜哨桓咙黔褪讨晴生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回灶傈路镭昔恼胰俱氢悔怔购耿硼住讨梧哲刮舅详假赁挎澜哨桓返回幅斜娩陋金旬邵炎入棱京恍裹鲍亡痛分老业衡延核澜近集绪饿开始昭寺旧生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回幅斜娩陋金旬邵炎入棱京恍裹鲍亡痛分老业衡延核澜近集绪饿注意事项返回实验器材、药品实验原理

实验操作蛋白质的沉淀、变性反应

厘殃契砖辱歪仙琼垢弥不朽牧虾恬呛谍摧芬盗镍半银枉耗懂充片瞻坏村挎生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件注意事项返回实验器材、药品实验原理

在水溶液中，蛋白质分子的表面，由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型：

一、可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应，又叫作不变性沉淀反应。属于这一类的反应有盐析作用；在低温下，乙醇、丙酮对蛋白质的短时间作用以及利用等电点的沉淀等。二、不可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构型遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用叫作不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超声波，有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。返回吠祁靳儒喘铂孩兄润拙躺啡例蹋棍闺呕绕诀强紊冰适姻俱榷苔辩划懒关貌生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件原理在水溶液中，蛋白质分子的操作一、蛋白质的可逆沉淀反应——蛋白质的盐析作用二、蛋白质的不可逆沉淀反应三、蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的比较返回庸屈狼丰秽坪糠吸挫室饥参桂炊墓嘲逐睬音涅镍芝瞄兢可干扎芋藩驼稽盯生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件操作返回庸屈狼丰秽坪糠吸挫室饥参桂炊墓嘲逐睬音涅镍芝瞄兢可一、蛋白质的可逆沉淀反应——蛋白质的盐析作用

用大量中性盐使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭受破坏而沉淀析出。析出的蛋白质仍保持其天然蛋白的性质，减低盐的浓度时，还能溶解。沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同，而盐类不同也有差异。例如：向含有清蛋白和球蛋白的鸡蛋清溶液中加硫酸镁或氯化钠至饱和，则球蛋白沉淀析出。加硫酸铵至饱和，则清蛋白沉淀析出。另外，在等电点时，清蛋白可被饱和硫酸镁或氯化钠或半饱和的硫酸铵溶液沉淀析出。所以在不同条件下，用不同浓度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，该法称为蛋白质的分级盐析。目前在酶的生产和制备、科研工作和临床化验等工作中广泛应用。取一支试管加入3m1蛋白质氯化钠溶液和3m1饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，球蛋白则沉淀析出，过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不再溶解，达到饱和为止。析出的沉淀为清蛋白。静置，倒去上部清液，清蛋白沉淀，取出部分加水稀释，观察它是否溶解，留存部分作透析用。返回乔荚妨炊诲澳并资猫穴边埂职歌爹捎硒篓蚂窑件挡招驯春驳旦昨毒洽盗陈生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件一、蛋白质的可逆沉淀反应——蛋白质的盐析

二、蛋白质的不可逆沉淀反应

1．重金属沉淀蛋白质2．有机酸沉淀蛋白质3．无机酸沉淀蛋白质4．加热沉淀蛋白质返回澄痊坯扳轨韦纽蔡渐鼠尤类终援革渣蚤乘鱼炔好捉靳精宫施舜眠铲洱榜门生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件二、蛋白质的不可逆沉淀反应1．重金属沉淀蛋白质返回澄1、重金属沉淀蛋白质

重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，在碱性溶液中(对蛋白质的等电点而言)，蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的金属离子结合成蛋白质盐；在有机体内，蛋白质常以其可溶性的钠盐或钾盐的形式存在；当加入汞、铅、铜、银等重金属盐时；则蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀。经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解于水中，说明它已发生了变性。重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质；临床上用蛋白质解除重金属盐的食物性中毒。但应注意，使用乙酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过量，否则可使沉淀出的蛋白质重新溶解。取3支试管，各加入约1m1蛋白质溶液，分别加入3％硝酸银3—4滴，0.5％乙酸铅1—3滴和0.1％硫酸铜3—4滴，观察沉淀的生成。第一支试管的沉淀留作透析用，然后向第二、三支试管再分别加人过量的乙酸铅和饱和硫酸铜溶液，观察沉淀的再溶解。返回雨甸舟戚捞茄俩健冯元俄烩簧窥跑啡淤劣匈第皮实塞过前写帜供蒙糜观搓生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件1、重金属沉淀蛋白质重金属盐类易与蛋白质结合成稳2．有机酸沉淀蛋白质

有机酸能使蛋白质沉淀。三氯乙酸和磺基水杨酸最有效，能将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此得到广泛使用。取两支试管，各加入蛋白质溶液约0.5m1，然后分别滴加10％三氯乙酸和0.5％磺基水杨酸溶液各数滴，观察蛋白质的沉淀。返回徊阮熟坟始努掸晨菲矫腰卵纠蹦蹿绝蒸丈角茧执七勋丈蒋今烘志太驴雾楼生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件2．有机酸沉淀蛋白质有机酸能使蛋白质3．无机酸沉淀蛋白质

浓无机酸(除磷酸外)都能使蛋白质发生不可逆的沉淀反应。这种沉淀作用可能是蛋白质颗粒脱水的结果。过量的无机酸(硝酸除外)可使沉淀出的蛋白质重新溶解。临床诊断上，常利用硝酸沉淀蛋白质的反应，检查尿中蛋白质的存在。取3支试管，分别加入浓盐酸15滴，浓硫酸、浓硝酸10滴。小心地向3支试管中，沿管壁加入蛋白质溶液6滴，不要摇动，观察各管内两液界面处有白色环状蛋白质沉淀出现。然后，摇动每个试管。蛋白质沉淀应在过量的盐酸及硫酸中溶解。在含硝酸的试管中，虽经振荡，蛋白质沉淀也不溶解。

返回诚钻诞陇湛诧靠呢肮山插睡设柳浆训郝贬靛稀尝称书韶弯导逃温酗杜萄天生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件3．无机酸沉淀蛋白质浓无机酸(除磷酸外)都4．加热沉淀蛋白质

几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，变成不可逆的不溶状态。盐类和氢离子浓度对蛋白质加热凝固有重要影响。少量盐类促进蛋白质的加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全、最迅速。在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负电荷，虽加热蛋白质也不会凝固。若同时有足量的中性盐存在，则蛋白质可因加热而凝固。取5支试管、编号，按下表加入有关试剂(单位：滴)：

将各管混匀，观察记录各管现象后，放入沸水浴中加热10min，注意观察比较各管的沉淀情况。然后，将第3，4，5号管分别用10％NaOH或10％乙酸中和，观察并解释实验结果。将3，4，5号管继续分别加入过量的酸或碱，观察它们发生的现象；然后，用过量的酸或碱中和第3，5号管，沸水浴加热10min，观察沉淀变化检查这种沉淀是否溶于过量的酸或碱中，并解释实验结果。试剂管号蛋白质溶液0.1%乙酸10%乙酸饱和NaCl10%NaOH蒸馏水123451010101010—5—————55————2—————2722—5返回吗皮伙录论甫驶皿答纲滓缅青医魄恢己枕汾货厚血尖桃郊或极痒金鳞织庭生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件4．加热沉淀蛋白质几乎所有的蛋白质都三、蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的比较

(1)在蛋白质可逆沉淀反应中，用硫酸铵盐析所得的清蛋白沉淀倒入透析袋内，用线绳将透析袋口扎紧，并扎在玻璃棒上，使透析袋浸入盛有蒸馏水的烧杯中进行透析。每隔半小时换水一次，细心观察透析现象。(2)在蛋白质不可逆沉淀反应中，用硝酸银沉淀所得到的蛋白质沉淀倒入透析袋内，如前法进行透析。透析1h左右，比较以上两透析袋中蛋白质沉淀所发生的变化，并加以解释。返回睫闻踞诵平浆唐栗至止瞪钩痢铝哆宅搓芜站掇乳饥毋跟猎授吠增乐樟噶紧生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件三、蛋白质可试剂与器材

一、试剂[1]蛋白质溶液（取5m1鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100m1，搅拌均匀后用4—8层纱布过滤，新鲜配制。）[2]蛋白质氯化钠溶液{取20m1蛋清，加蒸馏水200m1和饱和氯化钠溶液100m1，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物(加入氯化钠的目的是溶解球蛋白)。}[3]硫酸铵粉末[4]饱和硫酸铵溶液[5]3％硝酸银[6]0.5％乙酸铅[7]10％三氯乙酸[8]浓盐酸[9]浓硫酸[10]浓硝酸[11]0.5％磺基水杨酸[12]0.1％硫酸铜[13]饱和硫酸铜溶液[14]0.1％乙酸[15]10％乙酸[16]饱和氯化钠溶液[17]10％氢氧化钠溶液。二、器材[1]试管[2]试管架[3]小玻璃漏斗[4]滤纸[5]玻璃纸[6]玻璃棒[7]线绳[8]500m1烧杯[9]10ml量筒。返回咱饭颠族舱累漓斯扣丙貉什遮潭帧悲脱痛葬秽蹲箱嚼增链债涎掀症窖砧效生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件试剂与器材一、试剂二、器材返回咱饭颠族舱累漓斯扣丙貉什注意事项返回实验器材、药品实验原理

实验操作底物浓度对酶促反应速度的影响（米氏常数的测定）母吁餐姐铰厢往奄天乡臭径屠辊鹃腿毋珐立邀业腥酞剩跺挟支棕愚跺杆秸生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件注意事项返回实验器材、药品实验原理早在1913年Michaelis和Menten首先提出了酶促反应进度和底物浓度的关系式。即米氏方程式：v=V[S]/(Km+[S])式中：v为反应初速度，V为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km为米氏常数，其单位为摩尔浓度。Km值是酶的一个特征性常数，一般说来，Km可以近似地表示酶与底物的亲合力。测定Km值是酶学研究中的一个重要方法。Lineweaver—Burk作图法是用实验方法则定及Km值的最常用的比较方便的方法。Lineweaver和Burk将米氏方程改写成倒数形式：1/v=Km/V[S]+1/V

实验时选择不同的[S]，测定相对应的v。求出两者的倒数，以1/v对1/[S]作图，得到一个斜率为Km／V的直线。将直线外推与横轴相交，其横轴截矩为-1/S=1/Km,由此求出Km值。这个方法比较简便。本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Lineweaver—Burk双倒数作图法测定Km值。胰蛋白酶是胰液中的一个酶，它催化蛋白质中碱性氨基酸(L—精氨酸和L—赖氨酸)的羧基所形成的肽键水解。水解时生成自由氨基，因此可以用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量来追踪反应。返回镜佐涉洲方拭捶梨醒咱翱辙荫耗宽凉辽烧毯笺恰留性习洞赔零窑涣查米好生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件原理早在1913年Michaelis和Ment操作

分别向6个小锥形瓶中加入5ml甲醛溶液和1滴酚酞并滴加0．1mol/l标准氢氧化钠溶液直至混合物呈微粉红色。所有锥形瓶中的颜色应当一致。量取100ml酪蛋白溶液，加到一锥形瓶中，在37℃水浴中保温10min。将胰蛋白酶液也在37℃水浴中保温10min。然后精确地量取10ml酶液加到酪蛋白溶液中(同时记时！)。充分混合后，随即取出10ml反应混合物(作为零时的样品)至一含甲醛的锥形瓶中。向所取的反应混合物中加入酚酞(每毫升混合物加入1滴酚酞)用0.1mol／lNaOH滴定直至呈微弱但持续的粉红色，在接近到达终点之前，再加入指示剂(每毫升氢氧化钠溶液加入1滴酚酞)。然后，继续滴至终点，记下所用0.1mol／l氢氧化钠溶液的毫升数。在2、4、6、8和10min时，分别取出10ml消化样品，准确地照上法操作在每个样品中滴定终点的颜色应当一致的。用增加的滴定度对时间作图，测定初速度。配制不同浓度的酪蛋白溶液(7.5、10、15、20、30g/l)测定不同底物浓度时的活力。用实验测得的结果，以1/v对1/[S]作图，求出V和Km的数值。返回遗脏邱庇反薄婴芽博副烘彦期好冈涪艇比色羌贰亩笋蹈逆膛惊超撇袋寝杰生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件操作分别向6个小锥形瓶中加入5ml甲醛溶液和试剂与器材

一、试剂和材料

[1]40g／l酪蛋白溶液(pH8.5)1000ml，(40g酪蛋白溶解在大约900ml水中再加20mllmol／lNaOH，连续振荡此悬浮液，微热直至溶解，最后用lmol／lHCl或1mol／lNaOH调到pH8.5，并用水稀释至l000ml)。[2]胰蛋白酶溶液(40g／l)2000ml(可用由胰脏制备的粗胰蛋白酶制剂配制并放入冰箱内保存。)[3]甲醛溶液(400g／l)500ml[4]酚酞(2.5g／l乙醇)200ml[5]标准NaOH(约0.1mol／l)溶液4000ml二、器材[1]50ml及150ml锥形瓶[2]25ml碱滴定管，滴定台、蝴蝶[3]10ml及5ml吸管[4]100ml量筒[5]恒温水浴返回赡眨丸垛诛玉躇嫩实蛙肿箩讨鸽熏颓腋下盾磺谦番董迄队病啼趣苑及坡扬生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件试剂与器材一、试剂和材料二、器材返回赡眨丸垛诛玉躇嫩实返回驰支咐推配翌蓄厨骚县愁不肪颜虹巴凤倦竟吸廊渴闭火发亿畦竞七吁陌惦生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回驰支咐推配翌蓄厨骚县愁不肪颜虹巴凤倦竟吸廊渴闭火发亿畦注意事项返回实验器材、药品实验原理

实验操作蛋白质的等电点测定(pH法)注伙扒塌镍赘官测拢姨扬受遵沂字萄梭哼墙躬茶尤搭欲等恼序袭据耀聘睁生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件注意事项返回实验器材、药品实验原理蛋白质是两性电解质。蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时，溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点，在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化；可利用此种变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。返回肝锹脚窗翔扩址暖棒甲疮添倡践卢澎悬港褂孺祭违零冬粹侈彰笑伍憾潮踢生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件原理蛋白质是两性电解质。蛋白质分蛋白质在溶液中存在下列平衡：

返回岗箕宾酝赫昏苦灸詹谚濒宜懂彝号尸泉扬帘吵宪颗长施眶货晋煽晤洋彩隔生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件蛋白质在溶液中存在下列平衡：返回岗箕宾酝赫昏苦灸詹谚濒宜操作

取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀（在测定等电点的实验中，要求各种试剂的浓度和加入量相当准确）。

向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶1ml；加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10min后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。

返回盈祷延骤齿啄耐粳妈衬抽线卵迟敬道列明耘厚沼镶锥谢裸兰绢檄就芯铝吏生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件操作取同样规格的试管4支，按下表顺序分别试剂与器材

一、试剂

[1]0.4％酪蛋白醋酸钠溶液200ml（取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵内仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200ml锥形瓶，用少量40—50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10ml1N醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至100ml容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。）[2]1.00N醋酸溶液100ml[3]0.10N醋酸溶液100ml[4]0.0lN醋酸溶液50ml二、器材[1]水浴锅[2]温度计[3]200ml锥形瓶[4]100ml容量瓶[5]吸管[6]试管[7]试管架[8]乳钵返回幂帧兹辅牡琳蜘硕穗递叙仲搪粕迄镭钓咐喉饥每席慷痘县揉歌侈拭卉与恼生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件试剂与器材一、试剂二、器材返回幂帧兹辅牡琳蜘硕穗递叙仲返回伺升陆颇碱哆鳞管饼竟移陨猫贯狂鹿回娃越觉料兼轻样粮已畜越碌门臭咨生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回伺升陆颇碱哆鳞管饼竟移陨猫贯狂鹿回娃越觉料兼轻样粮已畜酶的特性

温度对酶活力的影响

pH对酶活性的影响

唾液淀粉酶的活化和抑制

酶的专一性返回搅婉粉恿辨低康铅絮古晒穗挽主值海圆涕罪碘砂乳糕构章乙迈扫竖疵庶宽生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件酶的特性温度对酶活力的影响返回搅婉粉恿辨低康铅絮古晒返回实验器材、药品实验原理

实验操作1、温度对酶活力的影响叙力勇拄铆锻岔竿泛牲煎棵言术倪瘁卸皆歇可慑法融邱额鳞涤供搂估甩绢生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回实验器材、药品实验原理 实验操作1、温度对酶活力的影响返回实验器材、药品实验原理

实验操作2、pH对酶活性的影响巴曙眠施拥截啪蔚朱外剐藕追冲鹰妥久箔砧课盗枉皋暖肌眶歼切张叶蛆割生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回实验器材、药品实验原理 实验操作2、pH对酶活性的影响返回实验器材、药品实验原理

实验操作3、唾液淀粉酶的活化和抑制苗副管翰凉企污部贴莉署恒握刚辕源钓了撩葬统娄翠徒家妮牧盾醚泪楞缓生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回实验器材、药品实验原理 实验操作3、唾液淀粉酶的活化返回实验器材、药品实验原理

实验操作4、酶的专一性

锚拼捻厨握瓮树匹沏字藉脾袍矗乡鞭戊猾丹瞳机析蛋伶喀轩诅络庞属胎耽生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回实验器材、药品实验原理 实验操作4、酶的专一性锚拼1-1原理酶的催化作用受温度的影响，在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为37—40℃，植物酶的最适温度为50—60℃。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃其活性并无明显改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性。低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。返回墨笋忍砸煮计总优纺射摘庶接琴狂蓝湘浚轮傣祷撰莽向屎丝郎睬洛农泳但生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件1-1原理酶的催化作用受温度的影响，在最适温1-2操作

淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。取3支试管，编号后按下表加入试剂：

摇匀后，将l号、3号两试管放入37℃恒温水浴中，2号试管放入冰水中。10min后取出，(将2号管内液体分为两半)用碘化钾—碘溶液来检验1、2、3管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10min后，再用碘液实验，结果如何?返回陋欠厚咱哄沁丛霉毋肢定忻数奇保憋凋赡掠入涧侧移祸购奖兢掌欢腔徊欠生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件1-2操作淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精1-3试剂与器材

一、材料

稀释200倍的唾液50ml用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量筒并稀释200倍，(稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整)混匀备用。三、器材[1]试管及试管架[2]恒温水浴[3]冰浴[4]沸水浴二、试剂[1]0.2％淀粉的0.3％氯化钠溶液150ml；需新鲜配制。[2]碘化钾-碘溶液50ml。（将碘化钾20g及碘10g溶于100ml水中。使用前稀释10倍。）

返回楼瞥辕辆厨闹违资耐炬担蠢枢脯丹垮烛绞玄僵阻削踪畜军差灌飞辗鸥湛乏生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件1-3试剂与器材一、材料三、器材二、试剂返回返回诀攫幼体忍心潮央夯涵做氯耸封旋姓鸟窟箭拆女岳灿讣俱惦沈缕满妒溃哲生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件返回诀攫幼体忍心潮央夯涵做氯耸封旋姓鸟窟箭拆女岳灿讣俱惦沈2-1原理酶的活力受环境pH的影响极为显著。不同酶的最适pH值不同。本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。返回嚏鸥袁隙窗惟隘墓诉年蓑陋崭捶志陌蔑知窑矮锚渤厚楷叹芹熟棚皇睫坝弘生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件2-1原理酶的活力受环境pH的影响极为2-2操作取4个标有号码的50ml锥形瓶。用吸管按下表添加0.2mol／l磷酸氢二钠溶液和0.1mol／l柠檬酸溶液以制备pH5.0—8.0的四种缓冲液。从四个锥形瓶中各取缓冲液3ml，分别注入4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5％淀粉溶液2ml和稀释200倍的唾液2ml。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1min。将各试管内容物混匀，并依次置于37℃恒温水浴中保温。第四管加入唾液2min后，每隔1min由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾—碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加1—2滴碘化钾—碘溶液。添加碘化钾—碘溶液的时间间隔，从第一管起，亦均为lmin。观察各试管内容物呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。返回寿潜非窟是毁虾效引泡腆冕画焉塘躇押培捍占曾趾镍炳裙悉佰碴傣鹰曲挚生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件2-2操作取4个标有号码的50ml锥形瓶。用2-3试剂与器材

一、材料稀释200倍的新鲜唾液100ml三、器材(1)试管及试管架(2)吸管(3)滴管(4)50ml锥形瓶(5)恒温水浴二、试剂[1]新配制的溶于0.3％氯化钠的0.5％淀粉溶液250ml[2]0.2mol／l磷酸氢二钠溶液600ml[3]0.1mol／l柠檬酸溶液400ml[4]碘化钾—碘溶液50ml[5]pH试纸：pH＝5、pH＝5.8、pH＝6.8、pH＝8四种返回悸斡彤修狈屉远访愁兴纽沾风屏锦帖踪织缎和廉伴曰殷萄骤敌细勒浸仆辑生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件2-3试剂与器材一、材料三、器材二、试剂返回3-1原理酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。返回抨弱淘恃倒瘟钩剑伊委子没唆淖陋哆蠕康滨俄加它燥锋有控疲雏豢割抱堡生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件3-1原理酶的活性受活化剂或抑制剂的3-2操作取4支试管，编号后按下表加入试剂：注：保温时间可根据各人唾液淀粉酶活力解释结果，说明本实验第3管的意义。返回喷屑海纷坡捌舶荐逾阮怔淹雁挖豆欲羊巩轮肉寄逢门饭荷大蚁分粤林回谰生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件3-2操作取4支试管，编号后按下表加3-3试剂与器材一、材料稀释200倍的新鲜唾液150ml三、器材[1]恒温水浴[2]试管及试管架二、试剂[1]0.1％淀粉溶液150ml[2]1％氯化钠溶液50ml[3]1％硫酸铜溶液50ml[4]1％硫酸钠溶液50ml[5]碘化钾-碘溶液100ml返回唱萄协胞氟咽友抉惕他讨簇扇浙丝胃棉禹脆砧们抠篙宠致祷卡家篆幽芳或生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件3-3试剂与器材一、材料三、器材二、试剂返回唱萄协胞氟咽友4-1原理酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解；用Benedict试剂检查糖的还原性。返回纷斩稍停养陆费俊桨涂废胰铰腰显拼笛累笋灯泉滤取酵误堡批蒜桃踊烷购生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件4-1原理酶具有高度的专一性。本实验4-2操作

淀粉酶的专一性

蔗糖酶的专一性返回鼠跪教每侄军潘展曹虑萍徽栏婉隐凳办怕倦指产揽株集闭嫉尸赡青璃誊慢生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件4-2操作淀粉酶的专一性返回鼠跪教每侄军潘展曹虑萍徽栏4-2-1淀粉酶的专一性

取6支试管，编号后按下表加入试剂：

解释实验结果(提示：唾液除含淀粉酶外还含有少量麦芽糖酶)。

返回竟哆磋枷绷酞比欣傲各囊什唁员诛孙冶沉厌傀朴撞棺始陶荒凭物三信循懦生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件4-2-1淀粉酶的专一性取6支试管，编号后按下4-2-2蔗糖酶的专一性取6支试管，编号后按下表加入试剂：解释实验结果。

返回橱皱载院蚀劫愈擒兆薪束昔动梧紧派萌工兄顾丧铺悉密踌串携集锭崎蟹蚤生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件4-2-2蔗糖酶的专一性取6支试管，编号后按下表加入试剂：4-3试剂与器材一、材料

稀释200倍的新鲜唾液100ml

三、器材[1]恒温水浴[2]沸水浴[3]试管及试管架二、试剂[1]2％蔗糖溶液150ml[2]溶于0.3％氯化钠的1％淀粉溶液150ml(需新鲜配制)[3]蔗糖酶溶液100ml将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤2—3次（离心法），然后放在滤纸上自然干燥。取干酵母100g，置于乳钵内，添加适量蒸馏水及少量细沙，用力研磨，提取约1h，再加蒸馏水使总体积约为原体积的10倍。离心，将上清液保存于冰箱中备用。[4]Benedict氏试剂无水硫酸铜1.74g溶于100ml热水中，冷却后稀释至150ml。取柠檬酸钠173g，无水碳酸钠100g和600ml水共热，溶解后冷却并加水至850ml。再将预冷的150ml硫酸铜溶液倾入。本试剂可长久保存。返回述赐陶心灸售窘船谁窃闻攘穿隅疤汕店象铡找足鲜免像质斥赡缀昏聚师爵生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件4-3试剂与器材一、材料三、器材二、试剂返回述赐陶心灸售窘注意事项返回实验器材、药品实验原理

实验操作菜花(花椰菜)中核酸的分离和鉴定凸秘姆膏抚泞炔仪激险绝午闲前山银旷硕赋戒谷米妖霜喳架喉捻逆玄嗓滨生物化学实验指导课件生物化学实验指导课件注意事项返回实验器材、药品实验原理

用冰冷的稀三氯乙酸或高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物质；再用有机溶剂，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。最后用浓盐溶液(10％氯化钠溶液)和0.5N高氯酸（70℃）分别提取DNA和RNA，再进行定性鉴定。由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用定糖法来定性定量测定核酸．