植物相关软件与方法rna-trizol

RNAextraction-Trizol主要流程准备耗材取出样品，在液氮中研磨成粉末，迅速转入2ml离心管适量Trizol中（1ml），剧烈混匀，室温静置20min，加入Trizol体积1/5的氯仿（200ul），剧烈混匀（1min）成乳浊液，静置分层（冰浴），12000g，4℃离心15min。上清约600ul，200ul×3，转入新的离心管中（2ml），，加入1/2-1/3（300-400ul）体积的水饱和酚（4℃会分层取下层液体），颠倒混匀成白色乳浊液，（冰浴）静置分层（5min），12000g，4℃离心15min。重复3，吸取上清，递减15ul。上清转移至1.5ml离心管，加入1/2体积氯仿剧烈混匀，冰浴分层。12000g，4℃离心15min。上清转移至1.5ml离心管中加入等体积的异丙醇（-20℃预冷），颠倒混匀(彻底混匀)，放置-20℃静置1h以上。去除，12000g，4℃离心25min。在超净工作台倒掉异丙醇，加入80%乙醇1ml（提前冰浴，由depc水配置），小心盖上盖子横滚几圈倒掉乙醇并用枪头吸取多余液体。再洗涤一次，加入80%乙醇，离心4-5min，倒掉乙醇。超净工作台吹干5min（一定要干）。加入适量（20ulDEPC处理过的超纯水），用枪头搅拌捣碎沉淀，方65度烘箱中5min，期间轻弹管子一次。稍离心。取上清到新的试管中，并分装少许检测，其余放-80℃。检测：OD值260/280=1.9-2.1或电泳1.关于Trizol的购买：目前市面上买的大多是100ml装的，比较出名的是Invitrogen公司的Trizol，100ml原装的据说要1200大洋以上，不过有一种据说香港分装的，只需600元，但是相对国产品牌三四百元的价格还是贵了一些。国产很多公司都有类似的Trizol试剂，价格大多三百多元，成分都差不多，可以说都是invitrogen的山寨产品。比如我用的是北京一家公司的，四百多，做出来也还不错。Takara有一款专门提取smallRNA的trizol，好像贵一些。2.关于配套试剂：Trizol法提取RNA是要用到氯仿、异丙醇和乙醇的。氯仿现在是违禁品，不大好买（我们学校试剂科现在不卖），所以买的时候要让试剂上给送，一般他们都能免费给送。氯仿遇光易分解，试剂商给你的时候应该是遮光的。异丙醇虽然没有特殊说明，但我查的据说也是最好避光保存，不过这种试剂都是棕色瓶子，能遮蔽大部分的光线了。3.关于实验时的防护：RNA很容易降解，所以实验时一般都要求口罩帽子的，避免组织的污染。不过以我的经验，好像内源性的RNA酶才是最主要的，也就是组织内本身的RNA酶。开始我是很小心，口罩手套帽子的，但是提取出来发现还是降解了，后来有经验了，即使组织掉在地上，拿回去继续提也没问题（前提是不能化冻）。所以最最重要的是组织在液氮研磨成粉末并加Trizol之前不能化冻，这也是fast200法提取效果不好的原因（fast200法一般不用液氮研磨）。4.关于液氮研磨：万事开头难，液氮研磨是最开始的步骤，也是最辛苦的步骤。很多女孩子都怕液氮，毕竟是零下近200度的东西，当然不是闹着玩的。不过只要小心操作，一般没啥问题，我提了一个多月的RNA，对液氮是很亲切了，呵呵。我是找了一个保温杯，倒出一些液氮，然后再往研钵里倒。研磨的时候多加几次液氮，组织会慢慢变脆，就会好研一些，对于一些含水量比较大，很硬的组织，我是准备了刀片，切成小块后再研磨，一定研磨充分，不要求研磨成奶粉状，但至少得看不到明显的颗粒，这样Trizol才能充分和组织接触，快速裂解组织，也能防止组织的降解（Trizol内含RNA酶抑制剂）。5.关于组织量：研磨前最后称一下组织的重量，毕竟1ml的Trizol最多只能裂解100mg的组织。Trizol里面是含有RNA酶抑制剂的，如果组织过量，Trizol无法完全浸润组织无法完全裂解组织，多余组织内的RNA酶等物质会导致RNA的降解。这是RNA降解的很重要的原因。6.关于提取步骤：标准Trizol提取步骤为液氮研磨--加入Trizol裂解--加入氯仿抽提--离心--加入氯丙醇沉淀--离心--酒精洗涤--离心。因为提取的组织，在加入Trizol后增加了一步简短的离心，可以帮助去掉一些无法降解的组织，比如纤维和杂质之类，然后取上清再加入氯仿，可以帮助提高氯仿的效率。然后就是在加入Trizol后，可以将裂解液放到-80冻存半小时以上，据说冻融过程中可以再次帮助更加充分的裂解细胞，分离蛋白和RNA。我试了一下，的确有效果。7.关于个步骤的时间：标准的时间是a.液氮研磨（没时间要求，只要组织不化就好,我一般一个组织十分钟左右，女孩子可能时间长一些，毕竟体力活）b.加入Trizol裂解5-10分钟（我觉得还是10分钟比较好，有人说这步要放在冰上，但是我的经验室温就可以，室温更有利于Trizol完全发挥作用，而且毕竟Trizol含有RNA酶抑制剂，不用担心RNA降解）c.加入氯仿室温静置15分钟（国产试剂真是坑爹啊，说明书把这步时间缩短到3分钟，出来效果奇差）d.离心15分钟，这是管见的一步，离心后分成三层，RNA在上清里，所以离心管从离心机拿出来的时候要轻巧，以免管内物质震荡导致下层沉淀激起。吸取上清的时候一定一定轻，切忌吸取太多，少量即可，洗到400-500ul就OK了，再多就容易碰到下层沉淀了。e.加入异丙醇静置10min，然后离心10min。f.用75%酒精洗涤沉淀，帮助分离剩余的有机试剂（剩余右击试剂过多会影响OD值和PCR反应），所以酒精尽量多加一些，一般说明书没有说明这一步的时间，只是说剧烈涡旋震荡，我的经验是一定把沉淀弹起来，让浮在酒精中，然后放1-2min，让酒精充分接触沉淀，充分溶解有机试剂，然后再离心。g.加入DEPC处理水，组织提取出来的量还是挺大的，虽然不是很纯，所以溶解液还是不能太少，至少要50ul，之前一个大姐给我说加20ul就可以，结果浓度直接高得光度计测不出来了。而且浓度太高跑电泳时也跑不开，没法