如何解决HPLC的残留问题

Carryover是我们日常生物分析工作中经常遇到的问题，Carryover过大将会影响数据的准确性。纠其原因，个人认为有与很多因素有关，下面我结合自己和其他老员工的经验，总结了一下Carryover的解决方法。1）首先要判断Carryover的来源，对症治疗才能快速、高效的解决问题。在排除污染和interference等因素后，需要确定Carryover是来源于进样针、进样阀、色谱柱还是系统管线等组件，具体的方法是：进样针第一种方法是其他条件都不变，在Run了一针ULOQ后，再进少量空气，看看Carryover是否比先前的小，如果小了说明针上有残留，根据减小的程度可判断化合物在针上残留的比例；如果不变，说明残留不在针上。第二种方法是在Run了一针ULOQ后，用一根新针或洗干净的旧针再进一针Blank,看看Carryover对比先前的变化，同样，如果小了说明针上有残留；如果不变，说明残留不在针上。第三种方法：在Run了一针ULOQ后，将CTC进样针卸掉，然后提交一针任何样品，观察Carryover的变化也能判断针上是否有残留。色谱柱第一种方法：在Run了一针ULOQ后，换一根同类型的柱子，然后进一针Blank,看看Carryover对比先前的变化，同样，如果小了说明柱上有残留；如果不变，说明残留不在色谱柱上。第二种方法：在采集方法液相梯度后再增加一个相同的梯度，然后进一针ULOQ，如果在ULOQ出峰后特定的位置出现一个小峰，则说明柱子上有残留，根据残留对比之前Carryover的变化，确定化合物在柱上残留的比例。进样阀确定针和柱子上的残留后，再来判断进样阀上的残留，残留的位置主要是进样阀的定子和转子的磨合处，判断的简单方法是在采集方法液相梯度G1后再增加一个相同的梯度G2，然后进一针ULOQ，在G1运行完后手动切换进样阀，如果在相应的位置出现一个小峰，则说明阀上有残留（注意扣除柱子上的残留）。另外还有一种方法就是在Run了一针ULOQ后，换一个干净的同类型阀，然后进一针Blank,看看Carryover的变化，也可确定阀上的残留比例。（注意：不要轻易拆卸和更换进样阀，尤其是对进样阀结构原理不大熟悉的同事，避免安装不好带来其他的不确定性，如有必要，请及时联系TDG组或者换台仪器试试）。管线除了进样针、进样阀、色谱柱外，残留还有可能存在于系统管线中（特别是柱前管线），管线弯曲的太厉害或者系统压力过大，Peek管线会出现死角和裂缝，同时系统压力过大可能会增加整个管路的死体积，这些都可能带来Carryover和不好的色谱峰形。因此判断Carryover的来源，可先从进样针和色谱柱开始然后再是阀，一般情况下，残留应该在这三个地方，为了提高判断的准确性，每个特定的来源（针，柱子，阀）最好应用两种方法加以确认。2）如果Carryover来源于进样针，具体的解决方法有：A.换一口新针。（残留可能是因为针老化了）B.换不同材质的进样针。（我这边可以尝试从HPLC转移到UPLC，但注意UPLC死体积小，相同条件下，出峰位置会靠前，而且UPLC有三种进样方式，每种进样方式对应的灵敏度，峰形和Carryover很可能有所不同）。C.尝试不同的洗针液，针对化合物的性质，强弱洗针液可以高低有机相，高低酸碱性，一酸一碱或一碱一酸搭配，一般弱洗液（WASH2）应与起始流动相相当。（洗针液中我们有时可考虑加入少许IPA和DMSO等溶剂以增加黏度和溶解强度，还可以加入一些挥发性的醋酸铵，甲酸铵等改善洗针液离子强度，万不得已可加入少量表面活性剂试试看）。D.加大洗针次数。3）如果Carryover来源于色谱柱，具体的解决方法有：如果是柱子老化了或污染了，建议换一根新柱。如果残留与柱子的性质有关，可试试其它类型的色谱柱。在之前的梯度后增加一个类似的梯度（整个采集时间会延长）。更换不同的流动相，调整液相梯度也是一个不错的方法，液相方法最好能有利于色谱柱再生。等度比梯度更有利于降低残留。4）如果Carryover来源于进样阀，具体的解决方法有：有时前面项目所用的流动相及其添加剂，洗针液，进样溶液等可能会在阀和系统管路中残留而对当前项目有所影响，建议有针对性的冲冲管路，最好冲管路的同时手动切换进样阀，使定子与转子之间的残留物洗净，必要时可将进样阀拆卸超声清洗。换不同类型的进样阀，如金属的换成Peek材质的。有些残留是我们在连接管线时引起的，比如Peek头切割的不规整，连接不够紧密等，例如下图两个短的Peek头相邻连接，造成两个Peek头都无法与进样阀紧密相连，产生空隙，导致峰形不佳，残留严重。正确的连接应是：5）其它的解决方法有：在灵敏度允许的情况下，减小进样量可减少Carryover。反相色谱多用金属进样阀，正相色谱多用Peek进样阀。洗针液的瓶子不应密封且其放置高度最好高于出口端。待续。总而言之，Carryover的解决是一个系统工程，如能一招制敌，建议改天去买点彩票吧