微生物学实验二 培养基配制、相关器皿的包扎及课件

实验二

培养基配制、相关器皿的包扎及消毒灭菌本次实验的目的和要求明确培养基制备原理通过对培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤了解消毒、灭菌的原理及方法，掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌学习并练习相关器皿的包扎方法内容一

培养基及无菌水的制备2、培养基制备原则和方法四个原则：目的明确；营养协调；物理化学条件适宜；经济节约。C/N：指在微生物培养基中所含的碳源中碳原子摩尔数与氮源中的氮原子摩尔数之比。四种方法：生态模拟；参阅文献；精心设计；试验比较。3、物理化学条件适宜的说明pH值：渗透压和水活度（aw）：

在同温同压下，某溶液的蒸气压（P）与纯水蒸气压（P0）之比。氧化还原电位：

针对厌氧菌分离特别需要注意（半胱氨酸、巯基乙醇酸钠等）4、培养基的分类（1）按成分分——对成分种类、量是否清楚

天然培养基合成培养基（组合培养基）半合成培养基（也称半组合培养基）（2）按物理状态分

固体培养基（凝固剂的使用1.5%-2.5%)；固体基质的使用）半固体培养基（凝固剂使用量较低0.2-0.7%）液体培养基（工业生产中的重要性）脱水培养基（也称预制干燥培养基）（3）按培养基对微生物的功能分基础培养基：含有一般微生物生长繁殖需要的基本营养物质。选择性培养基：根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。“投其所好、取其所抗”。——高通量筛选的建立。鉴别性培养基：在培养基中加入有能与目的菌的无色代产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。——直观、专一性（伊红美兰培养基，EMB）二、培养基的配方一个实验班共配置3种固体培养基：牛肉膏蛋白胨培养基高氏1号培养基马丁氏培养基按照老师的划分进行，每个实验小组都要准备，几个实验小组配1种培养基，供全班使用

可溶性淀粉20gNaCl0.5gKNO31.0gK2HPO4·3H2O0.5gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g琼脂15～25g水1000mlpH7.4～7.6

临用时无菌操作在800ml培养基中加入3%的K2Cr2O7溶液1ml2、高氏1号培养基（分离、培养放线菌用）

——500ml/组三、培养基配制的步骤1、计算按照配方要求（一般为1000ml的量）和实际配制培养基的量，计算出不同组分需要的量。2、称量、溶解按培养基配方在三角瓶中先加水（如无加入后大幅度改变原体积的物质，可以把水加足），然后依次准确称取各药品并分别逐一溶解于其中（琼脂需加热溶解），最后补充水到所需体积。（注意：各成分之间发生化学反应产生不溶的沉淀；培养基成分中有影响pH试纸的显色的物质，调pH值后再加入）3、调pH用5~10%NaOH、1~5%HCl溶液将培养基的pH调到所需范围，根据需要用精密pH试纸或pH计来确定。4、包扎（有一定规范要求）5、灭菌（高压蒸汽灭菌：121.3℃,15～30min）四、培养基配制过程中需注意的事项先加水——易产生沉淀逐一溶解——易产生沉淀调节pH——容易忘记加塞灭菌（或过滤除菌）——即时灭菌煮过或加热过培养基，注意水的蒸发——补足五、培养基配制中的2点说明1、量微的药品（天平无法称量），以溶液形式加入（先配制成一定浓度的溶液）；2、粘稠的药品和物品，称好后与称量纸一起放入溶液中，待药品溶解后取出称量纸；或利用减称量法完成（从总药品量中以减量称出所需要的量）。注意！！标记（记号笔）写在器皿壁或外包装纸上（如还需要高压蒸汽灭菌，只能写在外包装纸上）；不要直接写在瓶（管）塞或包装棉布上。内容二

消毒与灭菌高温灭菌或消毒的方法过滤除菌技术（正压和负压之分）滤膜过滤器——微孔滤膜（醋酸纤维、硝酸纤维、火棉胶、有机大分子物质），孔径0.22和0.45um。玻璃滤器——玻璃粉烧结板（G1~G6）蔡氏（Seitz）滤器——多层石棉纤维板（整体为金属制成）其它（不常见）——陶瓷、硅藻土制滤烛形：——张伯伦（Chamberland）滤器——伯克菲尔德（Berkefeld）滤器——曼德勒尔（Mandler）滤器不耐热的液体培养基的除（灭）菌膜过滤装置细菌截留于膜过滤器滤膜表面三、干热灭菌火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种方法。通常所说的干热灭菌是在电热干燥箱内利用高温干燥空气（160~170℃）进行灭菌，此法适用于玻璃器皿（吸管、培养皿等）的灭菌。干热灭菌需要注意的事项不能对塑料器皿和培养基灭菌；控制好温度和时间（160~180℃，2小时），防止包扎的报纸焦糊；灭菌过程（未完全冷下来，60℃以下）不要打开烘箱门，防止报纸着火或玻璃器皿遇冷爆裂。四、高压蒸汽灭菌锅的

结构及使用高压蒸汽灭菌的原理高压蒸汽灭菌器是利用加压的饱和蒸汽（潜热）对物品、器械、药液等灭菌的设备，适用于科学研究、医疗卫生、食品等实验室或工厂使用——造成蛋白质等变性失活。潜热是指当1g100℃的水蒸汽变成1g100℃水时，释放出2255.2J（1卡=4.184焦耳）的热量。各种高压蒸汽灭菌器之间的区别只在于自动化程度的高低（水位控制、温度恒定控制、时间控制、自动排放冷空气、程序化显示）饱和蒸汽压压力指示温度直接利用温度探测器指示温度典型的高压蒸汽灭菌锅纵剖面结构压力调节器安全阀排气口控制柄记录仪门垫圈放电器蒸汽阀蒸汽夹层阻板蒸汽供给蒸汽供应阀温度感应器蒸汽凝汽瓣废汽冷凝器蒸汽通入夹层蒸汽由夹层到灭菌室夹层冷凝水收集口蒸汽由夹层进入灭菌室和蒸汽排出口卧式灭菌锅示意图（简图）蒸汽进口灭菌过程出气口（冷空气和蒸汽）灭菌时间到排汽口压力表蒸汽排气阀温度计阀蒸汽供应阀门消毒室夹套（层）立式压力灭菌器手提式灭菌锅卧式矩型和圆型压力蒸汽消毒器高压蒸汽灭菌过程：1、取出内筒，检查水位；2、加水至淹过电发热管和内筒支架；3、放入内筒，并在其中放入需灭菌物品（要求松散）；4、加盖（对称旋紧），打开放汽阀；5、加热（有内外两种），升温；6、排除冷空气——由放汽阀冒汽3~5分钟；7、关闭放汽阀（有些灭菌锅灭菌过程中一直保持较小排气或到一定温度自动关闭），加压升温至所需温度或压力；8、保温定时至所需时间；9、不再加热，降温至压力表为“0”，打开放汽阀；10、开盖取物（注意蒸汽烫伤）。空气排除度对灭菌温度的影响压力表读数锅内温度（℃）kg/cm2磅/吋2MPa饱和蒸汽排除1/2空气不排除空气0.3550.031108.894720.70110.076115.6110901.05150.108121.31121001.40200.142126.21181091.75250.172130.01241152.10300.213134.6128121一些细菌芽孢湿热灭菌所需时间消毒、灭菌的生物指示菌嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus）结核分枝杆菌——致病菌指示菌（Mycobacteriumtuberculosis沙门氏菌——致病菌指示菌（通用检测）（Salmonellaspp）高压蒸汽灭菌效果的监测方法

（3种）1、工艺（程序）监测——压力表、温度计等，最常见，每次都使用；2、化学指示监测——特定化合物熔点（熔化前后晶体形态不同，硫磺熔点115℃、乙酰替苯胺116℃、脱水琥珀酸120℃、苯甲酸122.4℃等结晶）、灭菌指示胶带（变色反应）；3、生物指示剂监测——特定微生物（需经培养）。五、实验室常用灭菌方法1、高压蒸汽灭菌——常用121.3℃，20min和115℃，10min两种条件进行；适用于耐热性溶液、培养基和水的灭菌；2、热空气干热灭菌——160~170℃，2hr；适用于玻璃器皿和金属工具的灭菌；3、灼烧灭菌——酒精灯和电加热，适用于接种工具的灭菌；4、过滤除菌——现在一般使用微孔滤膜（0.22μm或0.45μm），适用于非耐热性溶液和培养基的过滤除菌。内容三

相关器皿的包扎方法一、器皿包扎的作用1、湿热灭菌时防止冷凝水的污染；2、灭菌后可以长期放置，保持器皿等的无菌状态和防止灰尘的污染。二、相关器皿的包扎要求利用报纸、牛皮纸或专用器械包扎，重点练习报纸包扎。1、培养皿的包扎——双层大报纸、12套包扎成1包2、吸管的的包扎——吸管先塞棉花（松紧适度），利用宽5cm左右的长条形报纸裹扎3、试管和三角瓶的包扎4、涂布器（刮子）的包扎三、包扎中的几点说明包扎纸大小适中，器皿或器材不外露，塞子、纱（棉）布、瓶口、管口等不外露。包扎试管和三角瓶时，包扎线向下一点，不要扎在塞子上。装有培养基等液体的容器，包扎过程或包扎好后不要倒置（包括水平放置），以免造成污染（塞子）和内装液体不准。四、利用吸管筒（铜制或不锈钢制）包扎吸管灭菌不锈钢吸管筒、培养皿筒本次实验完成的内容1、90mL无菌水1瓶（250mL三角瓶，内加玻璃珠）2、9mL无菌水6支