植物组培快繁研究

（_）树型金银花组培快繁技术的研究实验一组培室设备参观及器皿的洗涤和灭一、目的要求：通过参观，了解组织培养室的几个主要组成部分和各部分应有的基本设备以及有关仪器的用途与功能。通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。二、材料用具：高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、双筒解剖镜、酸度测定仪、空调机、控温仪、百分之一与万分之一天平、电炉、玻璃器皿（试管、三角瓶、移液管、漏斗、烧杯、容量瓶、试剂瓶、量筒酒精灯），以及疑子、解剖刀、解剖针、手术剪，肥皂、洗衣粉、重珞酸钾、浓硫酸等。三、说明：在进行各类具体的组培实验前，首先了解组培室的结构及主要设备的用途和性能是十分必要的，总体上的了解有利于以后各实验的进行以及正确的使用各种仪器和设备。植物组织培养是一项十分细致的工作，为了保证植物外植体不受污染，第一关就是要对各种器皿进行清洗和消毒，使它们保持无菌状态，做这些工作同样有一套科学的方法和需要熟练的技巧，因此每个学生必须学好这套基本功。四、方法和步骤：首先在老师带领下参观组培室，并听取讲解，然后配制洗液，称取工业用重珞酸钾40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制浓硫酸（或废硫酸）配好的溶液呈红色，铭酸洗液是一种强氧化剂，去污能力强，但玻璃器皿上沾有油脂、凡士林、石蜡等则用此液无效，铭酸洗液可反复使用，直到溶液呈青褐色为止。此溶液腐蚀性强，洗涤时需注意。每人清洗部分玻璃器皿，方法：清水洗净〜泡入洗衣粉水溶液中进行洗刷〜清水反复冲洗〜蒸馆水淋一遍〜烘干备用。然后清洗部分较脏的玻璃器皿，方法：采用先碱后酸，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净〜晾干一侵入酪酸洗液，浸泡时间视器皿的肮脏程度而定f清水反复冲洗干净f蒸懈水淋洗一遍f烘干备用。带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。1.215~20分钟。解剖刀、冷却后即可应用。五、作业：试阐述为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？实验二 母液的制备及培养基的配制、灭一、目的要求：通过掌握培养基对母液制备及常用培养基的配制和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件。二、材料用具：高压灭菌锅、冰箱、普通及精密天平、电炉、铝锅、玻璃器皿（烧杯、量微、容量瓶、移液管、试剂瓶、三角瓶、漏斗），化学试剂（CaCl2-2H2O,KNO3,MgSO八7HONH4NO3,KH2PO4,Na2—EDTA,FeSO^・7H）O,MgSO4•4H2O,Z11SO4・7H：O,H3BO3,KI,NaMoOr2H2O,CUSO4•5H2O,CoCl2•6H2O,甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸毗哆醇，烟酸，肌醇，蔗糖，琼脂，若干种生长调节物质及天然复合物，HCL,NaOH,酒精），以及称量纸、药匙、玻璃棒、精密度纸，瓶盖用纸，线绳或橡皮筋、铅笔、标签纸。三、说明：植物材料培养要获得成功，并正常生长，培养基的组成成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基，因此，在进行大量工作之前，对不同培养基应进行分析、比较、试验，选择或发展出一个符合试验材料需要的适宜培养基。人多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等。四、方法和步骤：（一）母液的制备母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成人屋元素、微量元素、维生素和铁盐等。配制母液时特别要注意无机盐成分在一起，可能产生的化学反应，如Ca”和SO2-4,Ca-+,Mg-+和POJ—起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存,应分别配制和保存。1MS培养基母液的配制成分规定用量/mg.L'1数称取量/mg母液定溶体积1MS培养基母液的配制成分规定用量/mg.L'1数称取量/mg母液定溶体积/ml1LMS培养基吸取量/nil母液I大量元素KNO3NH4NO3MgSO4•KH2PO4CaCh•2HzO母液II微量元素MnSOj•4H2OZ11SO4•7H2OH3BO3KINa2MoO4•2H：OCuSO4•5H：OCoCh•6H2O母液II【铁盐19001650370170440202020202038000330007400340088001000505050505010001000100100373027801010母液【丫有机物质1000甘氨酸盐酸硫胺素）2.00.150501005101022310002230018.61000860016.21000620010.83 100083010.25 100025010.025 10002510.025 1000251Na2-EDTA373FeSO4•7H2O27.8盐酸毗哆醇盐酸毗哆醇(Vit.B)6烟酸(Vit.Bj)肌醇0.50.51005050502525500010101大量元素和微量元素母液的配制按规定用量，称取所需的各种药品，在配制时为减少工作量，可以把儿种药品(如大量元素或微量元素)配在同一母液中(见表1).但由于各种药品的混合，可能发生反应，生成沉淀物，以致母液失效.为避免类似现象发生，在大量元素、微量元素和维生素及氨基酸的母液配制时，可采用如下2种做法加以解决：①将要配在同一母液的大量1”铁盐母液的配制铁盐的成份含硫酸亚铁(FeSO4-7H2O)和乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)FeSO4-7H20Na2-EDTA,2种溶液混PH5.5,植物生长调节物质母液的配制IAA、IBA、NAA,GA3,2,4-D、KT和6-BA等.由于大多数生长调节物质难溶于水，因此配制方法也各不相同：①IAA,IBAGA3先用少量95%②NAA可用热水或少量95%酒精溶解，再加水定容至所需容积；③2,4-D可溶于少许1mol-L4NaOH溶液中，然后加水定容；④KT6-BAlmol-L'1HC1溶95%酒精中，然后加水定容.ppm(mg•ml'1)mol•L-1ppm1mg•nil4(ppm)的母液，这个浓度既便于计算，也可避免冷藏时形成结晶.有机附加物母液的配制在植物组织培养时，培养基中往往要加入一些有机附加物，如椰子汁，以促进组织培养活性•由于椰子汁的活性成分是耐热的，在配制时，要先把由果实中采集到的汁液加热煮沸以除去其中的蛋白质，过滤，然后置塑料瓶中贮存于的-20°c的低温冰箱内.(二)培养基的配制12/31700ml积的水。2根据培养基配方，用量筒量取所需要的各种元素的母液。加入体积或重量大量元素母液(20X)铁盐母液(100X)有机物质母液(50X)蔗糖琼脂微量元素母液(1000X)

50ini10ml20ml30g8g1ml吸取母液时，注意应先将儿种母液按顺序排好，不要弄错以免使培养基中药品成分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素。加入一种母液后应先搅拌均匀，避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀，琼脂可于加入蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌，以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。加热至沸腾片断，以使琼脂充分溶解，检查时可注意烧杯内溶液是否透明。pHpHpH试纸测定pH1mol/LNaOH溶液、1mol/LHC1pHpH5.8,值要求也不同。培养基的灭菌一般用手提式医用高压锅來灭菌。培养基灭菌一般采用湿热灭菌法，即将分装好的培养基放在高压灭菌锅中，加热，待压力上升到0.5kg/cnr时，打开放气阀排净冷空气，关闭放气阀继续加热使压力稳定在l.l-1.2kg/cnr,温度为121摄氏度的条件卞，维持15 20分钟，培养基灭菌时间不宜过长，以防引起培养基成分的变化灭菌后的培养基置于室温卞贮存(最适宜的温度为10摄氏度),一般培养基在灭菌后二星期内应用。周内用完，最好不要超过一个月。五、作业MS培养基，先配母液，再配培养基，备用。制备母液时应注意哪些问题？为什么？实验三树型金银花愈伤组织的诱导和增殖的研究实验一、实验设计研究的技术路线伤条件。筛选出最优体系，具体技术路线如下图：外植体选取外植体表面灭菌愈伤组织的诱导愈伤组织的增殖图1技术路线试验方案植物的最佳繁育方法，首先是由其遗传特异性决定的，单就组织培养而言,它还受植物基因型、外植体种类、部位及培养基种类、激素类型及浓度、培养条件等诸多因素的影响。本试验在参考己有资料的基础上采用正交设计和随机区组试验设计，注重启动培养基配方的研究，各阶段设计方案如下：芽愈伤组织的诱导MS培养基为基本培养基，MS2346-BA,NAANAA8个处理的随机区组试验设计（2）。因素-123水平4因素-123水平456786-BA11.522.511.522.5NAA0.050.050.050.050.10.10.10.1茎段愈伤组织的诱导MS培养基为基本培养基，MS12.32.46-BA,NAANAA8个处理的随机区组试验设计（2）。叶片愈伤组织的诱导正交实验设计本试验也是以MS培养基为基本培养基，采用正交设计探索生长因子6-BA、2,4-D、NAA设三种水平（3）,构成四因素三水平的试验设计（4）。因素水平12因素水平1232,4-Dmg/L0.51.02.06-BAmg/L0.10.51.0NAAmg/L1.02.03.0蔗糖g/L153045处理2,4-D0.54叶片愈伤诱导正交设计表6-BANAA蔗糖10.111589220.5112451520.50.523030.51345410.1245510.5315611130720.1330单因素诱导叶片愈伤MS4-D（表5）,构成单因素四水平的试验设计。52,4-D单因素水平表水平（水平（mg/L）2,4-D10.521.031.542.0培养基的选择MS(MurashingandSkoog,1962)MSMS培养基为基本培养基，以节约时间和减少浪费。2培养基的灭菌121。。约llOPa20激素的选取根据外植体的不同分别选取了不同的激素，这些激素分别是:6-BA、NAA、2,4-Do外植体的选取①冬芽选取3月份未萌发的芽，去除外层叶片。②幼嫩茎段尽量选取茎段顶层。③叶片选取幼嫩叶片。外植体灭菌灭菌试剂的选取75%酒精，0.1%升汞，30%次氯酸钠。金银花芽的灭菌a灭菌试剂分别选用75%酒精+0.1%升汞、75%酒精+30%次氯酸钠这两种组合进行对比灭菌处理，选择最合适灭菌试剂。b灭菌时间75%酒精灭菌时间均为30s,6mmlOnuii次氯酸钠则分为两梯度，分别为20IIIUK及其最佳灭菌时间。c灭菌流程①75%酒精+0.1%升汞75%30s,0.1%升汞+12菌剂，用无菌水清洗外植体5-6次，直到外植体上没有泡沫即可。②75%酒精+30%次氯酸钠先用75%酒精浸泡30s,然后用无菌水清洗一次，倒去无菌水后，再用30%升汞+1〜2滴吐温灭菌，灭菌过程中不断摇动广口瓶使外植体充分接触灭菌剂，然后，倒出灭菌剂，用无菌水清洗外植体5-6次，直到外植体上没有泡沫即可。金银花幼嫩茎段的灭菌a灭菌试剂选用75%酒精+0.1%升汞这一组合进行灭菌。b灭菌时间75%酒精灭菌时间30s,0.1%升汞灭菌时间为6min、8min、lOmin这三个梯度。c灭菌流程先用75%酒精浸泡30s,然后用无菌水清洗一次，倒去无菌水后，再用0.1%升汞+1〜2滴吐温灭菌，灭菌过程中不断摇动广口瓶使外植体充分接触灭菌剂，然后，倒出灭菌剂，用无菌水清洗外植体5-6次，直到外植体上没有泡沫即可。金银花幼嫩叶片的灭菌1a灭菌试剂选用75%酒精+0.1%升汞这一组合进行灭菌。b灭菌时间75%酒精灭菌时间30s,0.1%升汞灭菌时间为3min>5nnn>6min这三个梯度。c灭菌流程先用75%酒精浸泡20s,然后用无菌水清洗一次，倒去无菌水后，再用0.1%升汞+1-2滴吐温灭菌，灭菌过程中不断摇动广口瓶使外植体充分接触灭菌剂，然后，倒出灭菌剂，用无菌水清洗外植体5-6次，直到外植体上没有泡沫即可。外植体的接种芽的接种培养基中即可将其放在培养室中培养架培养。茎段的接种0.5cm平放在培养基中后，即可将其放在培养室中培养架上培养。363叶片的接种0.5cmx0.5cm的小片，准备接种。叶片接种进行两种接种方法的对比：a叶片正面朝上b叶片反面朝上培养条件芽和茎段的培养条件温度24°C±2°C,光照16h黑暗8小时的光暗交替培养，日光灯。叶片的培养条件分两部分进行培养，从而寻找哪种培养条件适合叶片愈伤组织的诱导，以下为两中对比：a24°C±2°C15b另24°C±2°C16h8试验观察与统计数据记录及现象观察启动率=未污染外植体启动数/未污染外植体总数X100%污染率=接种污染数/接种总数X100%死亡率=未污染死亡数/X100%褐化率=未污染褐化数/X100%愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的块数/X100%记录数据时，既将其当成褐化外植体同时也当成产生愈伤的外植体。数据处理与分析SPSS13.0统计分析软件进行数据的方差分析。(二)野生种金银花和栽培种金银花绿原酸提取的比较实验金银花(厶onicerajaponica) ，乂称忍冬，是常见中药材之一，具有抗氧化、清除自由基、降血脂、降血压、预防心血管病、抗突变、抑菌解毒、消炎利胆等多种药理活性功能，其主要有效成分为绿原酸(CHA),常用的CHA含量的测定方法主要有紫外分光光度法(UV)、高效液相色(HPLC)法以及高效毛细管电泳(HPCE)法等。本实验釆用紫分光光度法(UV)。一、原理绿原酸为金银花的主要功能性成分，其药效高低取决于绿原酸的含量。绿原酸为咖啡酸奎尼酸衍生物，易溶于甲醇、乙醇、丙酮，微溶干乙酸乙醋,是一种重要的生理活性物质，它具有抗菌、抗病毒、解热、升高白细胞、保肝利胆、免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等作用。由干绿原酸分子中含有酚经基，其中酚经基与三氯化铁的产生显色反应，显色反应产物的光密度与绿原酸的含量呈良好的线性关系，因此建立了绿原酸含量的快速测定方法。二、仪器和试剂主要仪器：紫外分光光度计（UV2550型，日本岛津公司），可见分光光度计（S22PC型，上海棱光技术有限公司），医用数控超声波清洗器（KQ2250DE型，功100%,昆ft超声仪器有限公司）CHA（95%,美国Sigma公司0.01mol/LFeC13甲醇溶液，甲醇（Maik公司）花由杨进老师提供。二、方法测定波长的选择85%乙醇（体积分数）为溶剂；配制绿原酸对照溶液（50mg/L）,85%乙醇（积分数）200—OOnm,标准曲线的绘制105°C5mg,100mL85%乙醇（体积分数）溶解并稀释至刻度，摇匀，即为浓度50pg/mL的标准品溶液。1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0niL10mL量瓶85%乙醇（体积分数）85%乙醇（体积分数）在确定的波长处分别测定各溶液的吸光度（A）。计算回归方程。稳定性实验lh8h化？样品测定o105°Clg,85%（体积分数）20niL/r