DB37-T 4032-2020 非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范-（高清版）

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DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T4032—2020非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范TechnicalspecificationforisothermalamplificationdetectionofAfricanswinefever20202020070920200809山东省市场监督管理局发布前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范范围本标准适用于非洲猪瘟的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法原理单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶的催化下开始扩增。4试剂或材料除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶的催化下开始扩增。4试剂或材料除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。4.1水：GB/T66821×PBS(pH7.4A.1K（20mg/mL）：A.2；10（SDSpH7.2）A.3；Tris70A.4DEPCB.11.5mL5主要仪器设备10μL、20μL、100μL、1000μLPCR：Peltier16（0.2mL，2×8）0.001g8000样品GB19489—2008和NY/T541—2016无菌操作，采集猪口腔拭子。无菌操作，取猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2℃～8℃低温运至实验室。无菌操作，取猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2℃～8℃低温运至实验室。6.2.3环境样品相关场所的粪便、饲料、污水样品。2℃～8℃低温运至实验室。口腔拭子管6000r/min震荡45s，取200μL进行核酸提取。取0.05gPBS6000r/min45s，制成约10离心min，取200μL取1g粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000r/min震荡研磨45s，制成约10%的匀浆液，5000g离心5min，取200μL上清液进行核酸提取。取200μL污水进行核酸提取。7操作步骤7.1取6.250μL1%SS5μL2mgmL蛋白酶K10μL5h～37.2200μLTris，412000g15min7.3500μL200μLTris200μL412000g15min7.4400μL200μL412000g15min7.5300μL22020min，4℃12000g15min1mL7020μL20DNADNA50μLB.2DNAB.3C.1序号通道Ct值结果判断1FAM未检测到或40样本核酸浓度低于检测限，报告为阴性2FAM≤37报告为阳性3FAM37-40复检一次，如仍为37-40，则报告为阴性附录A（规范性附录）试剂的配制1×PBS(pH7.4)磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g。磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g。氯化钠(NaCl)：8g。氯化钾(KCl)：0.2g。加灭菌水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH值至7.4，最后定容到1L。K(20mg/mL)K100mg灭菌一级水5mL10(SDS溶液，pH7.2)1080mLpH7.2100mLA.470%乙醇无水乙醇70mL30mL附录B（规范性附录）恒温核酸扩增引物、反应液体系与反应条件见表B.1。表B.1恒温核酸扩增引物引物序列Asfv-F5’-CTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAC-3’Asfv-R5’-GAGATACAGCTCTTCCAGAYGCATGTTCATC-3’Asfv-Probe5’-AGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAACTTA[F]C[T]A[B]AAGATTGATACCATG-3’注：[F]为FAM荧光基团标记、[T]为THF、[B]为BHQ1淬灭基团标记、3’末端为C3Spacer标记。表B.2恒温核酸扩增反应液体系B.3恒温核酸扩增反应条件见表B.3。表B.2恒温核酸扩增反应液体系B.3恒温核酸扩增反应条件见表B.3。表B.3恒温核酸扩增反应条件组分用量μLDEPC水8.5ABuffer29.410μM上游引物210μM下游引物210μM探针0.6模板DNA5BBuffer2.5反应条件反应温度39ºC循环数40信号采集每30S反应时间20min图C.1样品检测结果图图C.1样品检测结果图附录C（规范性附录）样品检测结果图样品检测结果见图C.1。附录D（规范性附录）英文缩略表英文缩略表见表D.1。表D.1英文缩略表英文缩写英文全称中文名ASFVAfricanswinefevervirus非洲猪瘟病毒RPARecombina