基因工程一轮复习课件

基因工程一轮复习课件1恢复被限制酶切开的磷酸二酯键结果连接________________连接黏性末端功能T4噬菌体___________来源T4DNA连接酶E·coliDNA连接酶常用类型恢复被限制酶切开的磷酸二酯键结果连接____________23．载体(1)作用：①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内；②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。(2)具备的条件：①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接；③具有特殊的标记基因，以便进行筛选。(3)种类：①质粒：一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子；②噬菌体③动、植物病毒3．载体3一、基因工程的基本工具[判断正误](1)限制酶只能用于切割目的基因。()(2)限制酶切割DNA分子具有特异性。()(3)限制酶切割DNA后可产生黏性末端和平末端两种类型()

(4)DNA连接酶能将两碱基间通过形成氢键连接起来。()(5)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。()(6)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。()(7)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。()×√√××√√一、基因工程的基本工具[判断正误]×√√××√√41．与DNA重组技术相关的酶(1)几种酶的比较：种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键DNA重组技术的基本工具1．与DNA重组技术相关的酶种类限制酶DNA连接酶DNA聚合5种类项目

限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用特点切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上将DNA两条链之间的氢键打开作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子种类限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用切割目的基因及载6(2)限制酶与DNA连接酶的关系：①限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。②DNA连接酶起作用时不需要模板。(2)限制酶与DNA连接酶的关系：7基因工程一轮复习课件8【关键一点】(1)一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。(2)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。(3)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端以便连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。【关键一点】9[典例1]

(2010·江苏高考)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSmaⅠ识别序列及切割位点↓GGATCCCCTAGG↑

↓AAGCTTTTCGAA↑↓GAATTCCTTAAG

↑↓CCCGGGGGGCCC↑[典例1](2010·江苏高考)下表中列出10(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基团。

(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。

(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是____________________________。(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割11(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止________________。

(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入________酶。

(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_________。

(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在______的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamH12[答案]

(1)0、2(2)高(3)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因(4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化(5)DNA连接(6)鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞(7)蔗糖为唯一含碳源[答案](1)0、2(2)高13二、基因工程的操作程序基因文库PCR技术启动子标记基因二、基因工程的操作程序基因文库PCR技术启动子标记基因141．基因工程的操作程序分析(1)目的基因的获取途径：①从自然界现有的物种的细胞中分离出来，如从基因文库（cDNA文库）中获取。②人工合成目的基因：常用的方法有反转录法和化学合成法。③利用PCR技术扩增目的基因：通过PCR技术可对已获取的目的基因进行扩增，以获取大量的目的基因。基因工程的基本操作程序及与蛋白质工程的比较1．基因工程的操作程序分析基因工程的基本操作程序及与蛋白质工15PCR技术：是利用DNA复制的原理PCR循环PCR技术：是利用DNA复制的原理PCR循环16高温变性中温延伸低温复性PCR90~95℃55~60℃70~75℃高温变性中温延伸低温复性PCR90~95℃55~60℃70~17(2)基因表达载体的构建：【关键一点】(1)插入的目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入基因部位之前需有启动子，之后需有终止子。(2)两次使用的限制酶为同一种酶，这样形成的黏性末端碱基之间互补，便于连接。(2)基因表达载体的构建：【关键一点】18农杆菌转化法花粉管通道法显微注射农杆菌转化法花粉管通道法显微注射19(3)将目的基因导入受体细胞(转化)：生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子受体是植物细胞时，还可以用花粉管通道法、基因枪法(3)将目的基因导入受体细胞(转化)：生物种类植物细胞动物细20基因工程一轮复习课件21DNA分子杂交DNA-RNA分子杂交抗原—抗体杂交个体生物学水平DNA分子杂交DNA-RNA抗原—抗体杂交个体生物学水平22(4)目的基因的检测与鉴定：类型检测内容方法结果显示分子水平检测导入检测目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交(DNA和DNA之间)杂交带转录检测目的基因是否转录出mRNA分子杂交(DNA和mRNA之间)杂交带翻译检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原－抗体杂交杂交带个体生物学水平检测包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同等(4)目的基因的检测与鉴定：类型检测内容方法结果显示分子水平23基因工程一轮复习课件242．基因工程与蛋白质工程的比较项目区别与联系蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品2．基因工程与蛋白质工程的比较项目蛋白质工程基因工程区别过程25①蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出来的第二代基因工程；②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造联系只能生产自然界已有的蛋白质可生产自然界没有的蛋白质结果区别基因工程蛋白质工程项目区别与联系①蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出来的第二代基因工程；联261．[2014·天津卷]嗜热土壤芽胞杆菌产生的β­葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地应用，开展了以下试验：Ⅰ.利用大肠杆菌表达BglB酶(1)PCR扩增bglB基因时，选用________________________基因组DNA作模板。(2)下图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入______和______不同限制酶的识别序列。(3)大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述构建好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为____________。注：图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同【高考随堂体验】1．[2014·天津卷]嗜热土壤芽胞杆菌产生的β­葡萄糖苷27Ⅱ.温度对BglB酶活性的影响(4)据图1、2可知，80℃保温30分钟后，BglB酶会__________；为高效利用BglB酶降解纤维素，反应温度最好控制在________(单选)。A．50℃B．60℃C．70℃D．80℃图1温度对BglB酶活性的影响图2BglB酶的热稳定性Ⅱ.温度对BglB酶活性的影响图1温度对BglB酶活性的影28注：酶的热稳定性是酶在一定温度下，保温一段时间后通过其活性的保持程度来反映的Ⅲ.利用分子育种技术提高BglB酶的热稳定性在PCR扩增bglB基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB基因的突变率。经过筛选，可获得能表达出热稳定性高的BglB酶的基因。(5)与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽胞杆菌相比，上述育种技术获取热稳定性高的BglB酶基因的效率更高，其原因是在PCR过程中________(多选)。A．仅针对bglB基因进行诱变B．bglB基因产生了定向突变C．bglB基因可快速累积突变D．bglB基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变【答案】．(1)嗜热土壤芽胞杆菌(2)NdeⅠBamHⅠ(3)转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶(4)失活B(5)A、C注：酶的热稳定性是酶在一定温度下，保温一段时间后通过其活性的292．[2014·新课标全国卷Ⅱ]植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列问题：(1)理论上，基因组文库含有生物的________基因；而cDNA文库中含有生物的________基因。(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中________出所需的耐旱基因。(3)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物________的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的________，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的________是否得到提高。(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时，则可推测该耐旱基因整合到了______________________(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。全部部分筛选乙表达产物耐旱性同源染色体的一条上2．[2014·新课标全国卷Ⅱ]植物甲具有极强的耐旱性，其3036．[2014·山东卷]人组织纤溶酶原激活物(htPA)是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得。流程如下：(1)htPA基因与载体用________切割后，通过DNA连接酶连接，以构建重组表达载体。检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用____________技术。(2)为获取更多的卵(母)细胞，要对供体母羊注射促性腺激素，使其________。采集的精子需要经过________，才具备受精能力。36．[2014·山东卷]人组织纤溶酶原激活物(htPA)31(3)将重组表达载体导入受精卵常用的方法是________。为了获得母羊，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行________。利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，这体现了早期胚胎细胞的________。(4)若在转htPA基因母羊的羊乳中检测到__________，说明目的基因成功表达。【答案】．(1)同种限制性核酸内切酶(或同种限制酶)DNA分子杂交(或核酸探针)(2)超数排卵获能(处理)(3)显微注射法性别鉴定全能性(4)htPA(或人组织纤溶酶原激活物)(3)将重组表达载体导入受精卵常用的方法是________。321．(2012·新课标全国卷)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：

AATTC……G

G……CTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点_________________________________________________________________________________________。1．(2012·新课标全国卷)根据基因工程的有关知识，回答下33(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。(4)反转录作用的模板是________，产物是________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。(5)基因工程中除质粒外，________________和________________也可作为运载体。(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_______________。答案：(1)黏性末端平末端(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同(3)大肠杆菌T4

(4)mRNA(或RNA)cDNA(或DNA)PCR(5)噬菌体动植物病毒(6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即343．(2012·江苏高考)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：3．(2012·江苏高考)图1表示含有目的基因D的DNA片段35(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由________连接。(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是________末端，其产物长度为______________________。(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖平537bp、790bp、661bp4(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由____36(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是______________________________________________________________________。BamHⅠ抗生素B同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接374．(2012·天津高考)生物分子间特异性结合的性质广泛用于生命科学研究。以下实例为体外处理“蛋白质—DNA复合体”获得DNA片段信息的过程图。据图回答：(1)过程①酶作用的部位是________键，此过程只发生在非结合区DNA。过程②酶作用的部位是________键。(2)①、②两过程利用了酶的________特性。(3)若将得到的DNA片段用于构建重组质粒，需要将过程③的测序结果与________酶的识别序列进行比对，以确定选用何种酶。(4)如果复合体中的蛋白质为RNA聚合酶，则其识别、结合的DNA序列区为基因的________。4．(2012·天津高考)生物分子间特异性结合的性质广泛用于38(5)以下研究利用了生物分子间特异性结合性质的有_____(多选)。A．分离得到核糖体，用蛋白酶酶解后提取rRNAB．用无水乙醇处理菠菜叶片，提取叶绿体基粒膜上的光合色素C．通过分子杂交手段，用荧光物质标记的目的基因进行染色体基因定位D．将抑制成熟基因导入番茄，其mRNA与催化成熟酶基因的mRNA互补结合，终止后者翻译，延迟果实成熟答案：(1)磷酸二酯肽(2)专一性(3)限制性核酸内切(4)启动子(或转录起始区)(5)A、C、D(5)以下研究利用了生物分子间特异性结合性质的有_____答395．(2012·福建高考)肺细胞中的let­7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let­7基因导入肺癌细胞实现表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图1。5．(2012·福建高考)肺细胞中的let­7基因表达减弱40请回答：(1)进行过程①时，需用________酶切开载体以插入let­7基因。载体应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动let­7基因转录，该部位称为____________。(2)进行过程②时，需用____________酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于传代培养。(3)研究发现，let­7基因能影响癌基因RAS的表达，其影响机理如图2。据图分析，可从细胞中提取________进行分子杂交，以直接检测let­7基因是否转录。肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞中________(RASmRNA/RAS蛋白)含量减少引起的。答案：(1)限制性核酸内切(或限制酶)启动子(2)胰蛋白

(3)RNARAS蛋白请回答：答案：(1)限制性核酸内切(或限制酶)启动子416.（18分）（2013北京卷）斑马鱼的酶D由17号染色体上的D基因编码。具有纯合突变基因（dd）的斑马鱼胚胎会发出红色荧光。利用转基因技术将绿色荧光蛋白（G）基因整合到斑马鱼17号染色体上，带有G基因的胚胎能够发出绿色荧光。未整合G基因的染色体的对应位点表示为g。用个体M和N进行如下杂交实验。（1）在上述转基因实验中，将G基因与质粒重组，需要的两类酶是

和

。将重组质粒显微注射到斑马鱼

中，整合到染色体上的G基因

后，使胚胎发出绿色荧光。6.（18分）（2013北京卷）斑马鱼的酶D由17号染色体上42（2）根据上述杂交实验推测：①亲代M的基因型是

（选填选项前的符号）。a.DDggb.Ddgg②子代中只发出绿色荧光的胚胎基因型包括

（选填选项前的符号）。a.DDGGb.DDGgc.DdGGd.DdGg（3）杂交后，出现红·绿荧光（既有红色又有绿色荧光）胚胎的原因是亲代

（填“M”或“N”）的初级精（卵）母细胞在减数分裂过程中，同源染色体的

发生了交换，导致染色体上的基因重组。通过记录子代中红·绿荧光胚胎数量与胚胎总数，可计算得到该亲本产生的重组配子占其全部配子的比例，算式为

。【答案】（1）限制性核酸内切酶DNA连接酶受精卵表达（2）①b②b、d（3）N非姐妹染色单体4×（红·绿荧光胚胎数量/胚胎总数）（2）根据上述杂交实验推测：【答案】437．（16分）(2013广东卷)地中海贫血症属于常染色体遗传病。一对夫妇生有一位重型β地中海贫血症患儿，分析发现，患儿血红蛋白β链第39位氨基酸的编码序列发生了突变（C→T）。用PCR扩增包含该位点的一段DNA片段l，突变序列的扩增片段可用一种限制酶酶切为大小不同的两个片段m和s；但正常序列的扩增片段不能被该酶酶切，如图11（a）。目前患儿母亲再次怀孕，并接受了产前基因诊断。家庭成员及胎儿的PCR扩增产物酶切电泳带型示意图见图11（b）。（终止密码子为UAA、UAG、UGA。）7．（16分）(2013广东卷)地中海贫血症属于常染色体遗44（1）在获得单链模板的方式上，PCR扩增与体内DNA复制不同，前者通过__________解开双链，后者通过________解开双链。（2）据图分析，胎儿的基因型是_______（基因用A、a表示）。患儿患病可能的原因是_________的原始生殖细胞通过_______________过程产生配子时，发生了基因突变；从基因表达水平分析，其患病是由于_____________。（1）在获得单链模板的方式上，PCR扩增与体内DNA复制不同45（3）研究者在另一种贫血症的一位患者β链基因中检测到一个新的突变位点，该突变导致β链第102位的天冬酰胺替换为苏氨酸。如果____________，但____________，则为证明该突变位点就是这种贫血症的致病位点提供了一个有力证据。【答案】（1）高温解旋酶（2）Aa母亲减数分裂突变后终止密码子提前出现，翻译提前终止形成异常蛋白（3）该病可遗传给后代患者的β链不能被限制性酶切割（3）研究者在另一种贫血症的一位患者β链基因中检测到一个新的46基因工程一轮复习课件47恢复被限制酶切开的磷酸二酯键结果连接________________连接黏性末端功能T4噬菌体___________来源T4DNA连接酶E·coliDNA连接酶常用类型恢复被限制酶切开的磷酸二酯键结果连接____________483．载体(1)作用：①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内；②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。(2)具备的条件：①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接；③具有特殊的标记基因，以便进行筛选。(3)种类：①质粒：一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子；②噬菌体③动、植物病毒3．载体49一、基因工程的基本工具[判断正误](1)限制酶只能用于切割目的基因。()(2)限制酶切割DNA分子具有特异性。()(3)限制酶切割DNA后可产生黏性末端和平末端两种类型()

(4)DNA连接酶能将两碱基间通过形成氢键连接起来。()(5)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。()(6)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。()(7)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。()×√√××√√一、基因工程的基本工具[判断正误]×√√××√√501．与DNA重组技术相关的酶(1)几种酶的比较：种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键DNA重组技术的基本工具1．与DNA重组技术相关的酶种类限制酶DNA连接酶DNA聚合51种类项目

限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用特点切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上将DNA两条链之间的氢键打开作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子种类限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用切割目的基因及载52(2)限制酶与DNA连接酶的关系：①限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。②DNA连接酶起作用时不需要模板。(2)限制酶与DNA连接酶的关系：53基因工程一轮复习课件54【关键一点】(1)一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。(2)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。(3)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端以便连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。【关键一点】55[典例1]

(2010·江苏高考)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSmaⅠ识别序列及切割位点↓GGATCCCCTAGG↑

↓AAGCTTTTCGAA↑↓GAATTCCTTAAG

↑↓CCCGGGGGGCCC↑[典例1](2010·江苏高考)下表中列出56(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基团。

(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。

(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是____________________________。(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割57(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止________________。

(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入________酶。

(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_________。

(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在______的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamH58[答案]

(1)0、2(2)高(3)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因(4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化(5)DNA连接(6)鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞(7)蔗糖为唯一含碳源[答案](1)0、2(2)高59二、基因工程的操作程序基因文库PCR技术启动子标记基因二、基因工程的操作程序基因文库PCR技术启动子标记基因601．基因工程的操作程序分析(1)目的基因的获取途径：①从自然界现有的物种的细胞中分离出来，如从基因文库（cDNA文库）中获取。②人工合成目的基因：常用的方法有反转录法和化学合成法。③利用PCR技术扩增目的基因：通过PCR技术可对已获取的目的基因进行扩增，以获取大量的目的基因。基因工程的基本操作程序及与蛋白质工程的比较1．基因工程的操作程序分析基因工程的基本操作程序及与蛋白质工61PCR技术：是利用DNA复制的原理PCR循环PCR技术：是利用DNA复制的原理PCR循环62高温变性中温延伸低温复性PCR90~95℃55~60℃70~75℃高温变性中温延伸低温复性PCR90~95℃55~60℃70~63(2)基因表达载体的构建：【关键一点】(1)插入的目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入基因部位之前需有启动子，之后需有终止子。(2)两次使用的限制酶为同一种酶，这样形成的黏性末端碱基之间互补，便于连接。(2)基因表达载体的构建：【关键一点】64农杆菌转化法花粉管通道法显微注射农杆菌转化法花粉管通道法显微注射65(3)将目的基因导入受体细胞(转化)：生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子受体是植物细胞时，还可以用花粉管通道法、基因枪法(3)将目的基因导入受体细胞(转化)：生物种类植物细胞动物细66基因工程一轮复习课件67DNA分子杂交DNA-RNA分子杂交抗原—抗体杂交个体生物学水平DNA分子杂交DNA-RNA抗原—抗体杂交个体生物学水平68(4)目的基因的检测与鉴定：类型检测内容方法结果显示分子水平检测导入检测目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交(DNA和DNA之间)杂交带转录检测目的基因是否转录出mRNA分子杂交(DNA和mRNA之间)杂交带翻译检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原－抗体杂交杂交带个体生物学水平检测包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同等(4)目的基因的检测与鉴定：类型检测内容方法结果显示分子水平69基因工程一轮复习课件702．基因工程与蛋白质工程的比较项目区别与联系蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品2．基因工程与蛋白质工程的比较项目蛋白质工程基因工程区别过程71①蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出来的第二代基因工程；②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造联系只能生产自然界已有的蛋白质可生产自然界没有的蛋白质结果区别基因工程蛋白质工程项目区别与联系①蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出来的第二代基因工程；联721．[2014·天津卷]嗜热土壤芽胞杆菌产生的β­葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地应用，开展了以下试验：Ⅰ.利用大肠杆菌表达BglB酶(1)PCR扩增bglB基因时，选用________________________基因组DNA作模板。(2)下图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入______和______不同限制酶的识别序列。(3)大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述构建好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为____________。注：图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同【高考随堂体验】1．[2014·天津卷]嗜热土壤芽胞杆菌产生的β­葡萄糖苷73Ⅱ.温度对BglB酶活性的影响(4)据图1、2可知，80℃保温30分钟后，BglB酶会__________；为高效利用BglB酶降解纤维素，反应温度最好控制在________(单选)。A．50℃B．60℃C．70℃D．80℃图1温度对BglB酶活性的影响图2BglB酶的热稳定性Ⅱ.温度对BglB酶活性的影响图1温度对BglB酶活性的影74注：酶的热稳定性是酶在一定温度下，保温一段时间后通过其活性的保持程度来反映的Ⅲ.利用分子育种技术提高BglB酶的热稳定性在PCR扩增bglB基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB基因的突变率。经过筛选，可获得能表达出热稳定性高的BglB酶的基因。(5)与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽胞杆菌相比，上述育种技术获取热稳定性高的BglB酶基因的效率更高，其原因是在PCR过程中________(多选)。A．仅针对bglB基因进行诱变B．bglB基因产生了定向突变C．bglB基因可快速累积突变D．bglB基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变【答案】．(1)嗜热土壤芽胞杆菌(2)NdeⅠBamHⅠ(3)转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶(4)失活B(5)A、C注：酶的热稳定性是酶在一定温度下，保温一段时间后通过其活性的752．[2014·新课标全国卷Ⅱ]植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列问题：(1)理论上，基因组文库含有生物的________基因；而cDNA文库中含有生物的________基因。(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中________出所需的耐旱基因。(3)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物________的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的________，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的________是否得到提高。(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时，则可推测该耐旱基因整合到了______________________(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。全部部分筛选乙表达产物耐旱性同源染色体的一条上2．[2014·新课标全国卷Ⅱ]植物甲具有极强的耐旱性，其7636．[2014·山东卷]人组织纤溶酶原激活物(htPA)是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得。流程如下：(1)htPA基因与载体用________切割后，通过DNA连接酶连接，以构建重组表达载体。检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用____________技术。(2)为获取更多的卵(母)细胞，要对供体母羊注射促性腺激素，使其________。采集的精子需要经过________，才具备受精能力。36．[2014·山东卷]人组织纤溶酶原激活物(htPA)77(3)将重组表达载体导入受精卵常用的方法是________。为了获得母羊，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行________。利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，这体现了早期胚胎细胞的________。(4)若在转htPA基因母羊的羊乳中检测到__________，说明目的基因成功表达。【答案】．(1)同种限制性核酸内切酶(或同种限制酶)DNA分子杂交(或核酸探针)(2)超数排卵获能(处理)(3)显微注射法性别鉴定全能性(4)htPA(或人组织纤溶酶原激活物)(3)将重组表达载体导入受精卵常用的方法是________。781．(2012·新课标全国卷)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：

AATTC……G

G……CTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点_________________________________________________________________________________________。1．(2012·新课标全国卷)根据基因工程的有关知识，回答下79(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。(4)反转录作用的模板是________，产物是________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。(5)基因工程中除质粒外，________________和________________也可作为运载体。(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_______________。答案：(1)黏性末端平末端(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同(3)大肠杆菌T4

(4)mRNA(或RNA)cDNA(或DNA)PCR(5)噬菌体动植物病毒(6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即803．(2012·江苏高考)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：3．(2012·江苏高考)图1表示含有目的基因D的DNA片段81(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由________连接。(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是________末端，其产物长度为______________________。(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖平537bp、790bp、661bp4(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由____82(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是______________________________________________________________________。BamHⅠ抗生素B同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接834．(2012·天津高考)生物分子间特异性结合的性质广泛用于生命科学研究。以下实例为体外处理“蛋白质—DNA复合体”获得DNA片段信息的过程图。据图回答：(1)过程①酶作用的部位是________键，此过程只发生在非结合区DNA。过程②酶作用的部位是________键。(2)①、②两过程利用了酶的________特性。(3)若将得到的DNA片段用于构建重组质粒，需要将过程③的测序结果与________酶的识别序列进行比对，以确定选用何种酶。(4)如果复合体中的蛋白质为RNA聚合酶，则其识别、结合的DNA序列区为基因的________。4．(2012·天津高考)生物分子间特异性结合的性质广泛用于84(5)以下研究利用了生物分子间特异性结合性质的有_____(多选)。A．分离得到核糖体，用蛋白酶酶解后提取rRNAB．用无水乙醇处理菠菜叶片，提取叶绿体基粒膜上的光合色素C．通过分子杂交手段，用荧光物质标记的目的基因进行染色体基因定位D．将抑制成熟基因导入番茄，其mRNA与催化成熟酶基因的mRNA互补结合，终止后者翻译，延迟果实成熟答案：(1)磷酸二酯肽(2)专一性(3)限制性核酸内切(4)启动子(或转录起