端粒端粒酶教案课件

会计学1端粒端粒酶第1页/共143页会计学1端粒端粒酶第1页/共143页端粒端粒是位于真核细胞线性染色体末端的特殊结构,由一段重复串联的DNA序列与端粒结合蛋白构成；端粒具有稳定染色体,防止末端降解和融合的功能；端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而变短,端粒DNA逐渐变短而消失,可导致染色体稳定性下降并导致衰老。第2页/共143页端粒端粒是位于真核细胞线性染色体末端的特殊结构,由

端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸－蛋白复合体,其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。端粒酶是一种核酸核蛋白酶,能以自身的RNA为模板合成端粒的重复序列,以维持端粒长度的稳定性。许多研究表明,端粒、端粒酶的功能失调将影响细胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细胞增殖、癌变、凋亡、衰老。

第3页/共143页端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。第3页/第4页/共143页第4页/共143页●端粒的发现

1938MullerX-rayDrosophila

末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定.并定名为Telomere

1938B.McClintock

顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。推测染色体末端具有特殊端粒结构。七十年代端粒分子组成确定八十年代端粒酶的发现九十年代端粒酶与细胞衰老、癌症的关系二零零九年诺贝尔奖第5页/共143页●端粒的发现1938Muller末端极少发生缺失和伊丽莎白•布兰克波恩、卡罗尔•格雷德、杰克•绍斯塔第6页/共143页伊丽莎白•布兰克波恩、卡罗尔•格雷德、杰克•绍斯塔第6端粒的结构与功能第7页/共143页端粒的结构与功能第7页/共143页第8页/共143页第8页/共143页ChromosomeDNAGene1Gene2TelomeresTelomeresTTAGGG第9页/共143页ChromosomeDNAGene1Gene2Telom第10页/共143页第10页/共143页1.端粒的组成

端粒DNA与端粒结合蛋白端粒DNA

重复:

端粒DNA由高度重复短核苷酸序列组成。人：-TTAGGG-重复序列

保守：为不含功能基因的简单、高度重复序列,

在生物进化过程中具有高度保守性。不同物种的端粒DNA序列存在差异。人类及其它脊椎动物染色体端粒的结构是5′TTAGGG3′的重复序列。体细胞的端粒有限长度（telomererestrictionfragmentsTRFS）大多数明显短于生殖细胞，青年人的TRFs又显著长于年长者，提示TRFs随着细胞分裂或衰老，在不断变短，主要是由于DNA聚合酶不能完成复制成线性DNA末端所致。第11页/共143页1.端粒的组成第11页/共143页

端粒DNA由两条互相配对的DNA单链组成,其双链部分通过与端粒结合蛋白质TRF1和TRF2结合共同组成t环(tloops)。这种t环特殊结构可维持染色体末端的稳定,保持染色体及其内部基因的完整性,从而使遗传物质得以完整复制。缺少端粒的染色体不能稳定存在。端粒DNA与结构蛋白形成的复合物如同染色体的一顶“帽子”，它既可保护染色体不被降解，又避免了端粒对端融合（end-endfusion）以及染色体的丧失，同时端粒能帮助细胞识别完整染色体和受损染色体。在生理情况下，端粒作为细胞“分裂时钟”能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。

第12页/共143页端粒DNA由两条互相配对的DNA单链组成,第13页/共143页第13页/共143页端粒DNA的长度：

端粒DNA的平均长度因物种而异。

端粒DNA的长度总是波动变化，随遗传或营养状态而改变。人体中，随细胞分裂，会缓慢缩短。Telomerelength第14页/共143页端粒DNA的长度：端粒DNA的平均长度因物种而异。

端粒DNA重复序列T四膜虫，酵母，植物，蚕，人第15页/共143页第15页/共143页端粒结合蛋白第16页/共143页端粒结合蛋白第16页/共143页

与端粒DNA上的特异序列相结合的蛋白质称为端粒结合蛋白。

人端粒重复序列结合因子(Telomericrepeatfactor，TRF)，包括TRF1和TRF2。

TRF1通过负反馈机制抑制端粒增长，稳定端粒长度，其并不抑制端粒酶(telomerase)的表达而是抑制它在端粒末端的行为第17页/共143页与端粒DNA上的特异序列相结合的蛋白质称为端粒结合

TRF1，是一个60kD的蛋白，结合同源二聚体双链TTAGGG重复序列，包含一个C端螺旋-转折-螺旋区和一个DNA结合折叠同源区，N端是酸性区。第18页/共143页第18页/共143页

TRF2，与TRF1相似，但N端碱性强。可以防止染色体末端相互融合。两种蛋白在体外都专一与双链TTAGGG重复序列结合，在体内则位于端粒。人该环DNA与TRF1、TRF2结合，TRF2参与T环形成。“T环”保护3’端对抗双链破坏的核酸酶作用。）第19页/共143页TRF2，与TRF1相似，但N端碱性强。可以防止染色体TelomereT-loop第20页/共143页TelomereT-loop第20页/共143页第21页/共143页第21页/共143页第22页/共143页第22页/共143页第23页/共143页第23页/共143页第24页/共143页第24页/共143页2.端粒的功能第25页/共143页2.端粒的功能第25页/共143页端粒酶的结构与功能第26页/共143页端粒酶的结构与功能第26页/共143页端粒酶是一种RNA-蛋白质复合物，第27页/共143页端粒酶是一种RNA-蛋白质复合物，第27页/共143页

在端粒被发现以前，人们就推测生殖细胞之所以能世代相传，其中可能存在一种维持端粒长度的特殊机制，体细胞可能正是由于缺乏这种机制，它的染色体末端才面临着致死性缺失（deletion）的危险。因此在正常人体细胞间永生化细胞（immortalizedcells）及肿瘤细胞的转化过程中可能也存在着与生殖细胞类似的机制。这些细胞怎样保持细胞具有继续分裂或长期分裂的能力呢？科学家们发现端粒确实随着每次分裂而缩短，但也会被新合成的端粒片断再延长。科学家们怀疑，可能尚有末被发现的酶，该酶具有标准的DNA多聚酶所不具备的功能，能使已缩短的端粒延长，使科学家们兴奋的是到1984年首先在四膜虫中证实了这种能使端粒延长的酶—端粒酶的存在。

第28页/共143页第28页/共143页

端粒酶的结构端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由RNA和结合的蛋白质组成,是RNA依赖的DNA聚合酶。它是一种特殊的能合成端粒DNA的酶,通过明显的模板依赖方式每次添加一个核苷酸。

端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶

端粒酶RNA(hTR)

端粒酶逆转录酶（TERT）端粒酶结合蛋白（TEP）

第29页/共143页端粒酶的结构第29页/共143页

1、端粒酶RNA(hTERT)

哺乳动物端粒酶RNAs(hTR)在许多组织的不同发育阶段,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛表达。体内端粒酶RNA的存在对端粒酶功能至关重要，影响到端粒酶RNA的稳定性与突变,也可改变体内端粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡。端粒酶RNA转录模板远端区:参与和底物的结合。近端区:能添加特定的核苷酸,对底物识别并不重要。模板边界区:与端粒酶催化亚基TERT结合,也与端粒酶相关因子Est1p和Ku结合。第30页/共143页1、端粒酶RNA(hTERT)第30页/共143页TelomeraseRNAThetemplateregionMainTERT-bindingregionTemplateboundaryelement(TBE)TRE,TemplaterecognitionelementLowaffinityTERTbindingsitesAnnu.Rev.Biochem2006,75:493-517第31页/共143页TelomeraseRNAThetemplatereg2、端粒酶逆转录酶(Telomerasereversetranscriptase,TERT)

几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的TERT基因,哺乳动物TERT的转录由许多转录因子、激素和细胞外信号严格控制。不同的转录因子调节hTERT在不同的细胞内含物中的表达。癌基因c-myc是一个受特殊信号调节的可诱导癌基因,并可与H－Ras、N－Ras、多瘤病毒MT、LT等癌基因协同作用,促进细胞无限增殖,获得永生化并发生癌变。第32页/共143页2、端粒酶逆转录酶(Telomerasereverset人端粒酶逆转录酶

（humanTelomeraseReverseTranscriptase(TERT),）

TERTgene:3396bp,

protein:

1131氨基酸残基CrystalStructureoftheEssentialN-terminal

ofthetelomerasereversetranscriptase(TEN)C-terminaldomainofTERTNaturestructureal&molecularbiology2006,13:218-225第33页/共143页人端粒酶逆转录酶（humanTelomeraseRev

c-myc与hTERT

Fujimoto等用c-myc反义寡核甘酸转染白血病细胞后,这些细胞中端粒酶活性均能被下调,而c-myc正义寡核甘酸无此作用。

Wang等研究发现c-myc在正常人乳腺上皮细胞和二倍体成纤维细胞中诱导端粒酶活性,并能延长这些细胞的寿命。因此认为癌基因c-myc为一重要的端粒酶激活剂。

存在于hTERT核心启动子中有两个重要的c-myc结合位点(CACGTG,亦被称为E盒)。c-myc诱导的hTERT表达起始速度快,不受细胞增殖或额外的蛋白合成的影响,与c-myc引起的直接的转录激活一致。但癌基因c-myc不是唯一与hTERT基因调节有关的转录因子。第34页/共143页c-myc与hTERT第34页/共143页

近期研究表明,Sp1协同c-myc激活hTERT的转录,可能还有其他因子,如Bcl-2抗凋亡基因、E6HPV16型蛋白，以及经过一些蛋白激酶的磷酸化使hTERT上调。但在诸多不同类型的瘤细胞中,致hTERT上调的基本激活剂是c-myc。

TERT内的N-残基对多种功能是重要的,包括与端粒酶RNA结合、端粒酶RNA装配和催化作用、与p53的相互作用和细胞永生化。

TERT的C-残基也在人类原始纤维母细胞的永生化、端粒组装的竞争、核仁内定位、引物结合和渐进性延长等方面起重要作用。

第35页/共143页近期研究表明,Sp1协同c-myc激活hTERT3、端粒酶相关蛋白(TEP)⑴端粒酶相关蛋白-1(TEP1)是一多功能的RNA结合蛋白，TEP1缺失导致rRNA水平的显著降低以及TEP1和rRNA的丢失,但不导致端粒酶活性或端粒长度的紊乱。⑵生存动力神经细胞基因(SMN)产物热休克蛋白（hsp）90、其他涉及到TERT转录后修饰的蛋白包括磷酸酶-A、Akt、cAbl、p53和PARP。PinX1与人TERT体外共表达时抑制人端粒酶活性。⑶芽殖酵母蛋白Est1p和Est3p这两个蛋白与体内端粒酶的功能有关。Est1p足以使端粒延长。但是,在无Est1p存在的情况下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以维持端粒长度。第36页/共143页3、端粒酶相关蛋白(TEP)第36页/共14人端粒酶RNA(humanTelomeraseRNA(hTRorTERC).hTR:451nt,

第37页/共143页人端粒酶RNA(humanTelomeraseRNATelomeraseiscomposedofbothRNAandprotein第38页/共143页TelomeraseiscomposedofbothTelomeraseTelomeraseisaspecializedreversetranscriptase,containsbothRNAandProteinScience1997,276:561-567第39页/共143页TelomeraseTelomeraseisa第39页/端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆转录酶（TERT）端粒酶结合蛋白（TEP）端粒酶RNA是第一个被克隆的端粒酶组分。端粒酶RNA含有与同源端粒DNA序列TTAGGG的互补序列,核糖核酸酶H切割此模板区,能使体外消除端粒酶延长端粒的功能。人类TERT（hTERT）基因为一单拷贝基因,定位于5p15.33,具有7个保守序列结构域单元和端粒酶特异性结构域单元T。破坏TERT将消除端粒酶活性并致端粒缩短。TEP1、生存动力神经细胞基因(SMN)产物、hsp90

、PinX1、Est1p和Est3p

第40页/共143页端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆转录酶（TERT）端粒酶结合蛋第41页/共143页第41页/共143页第42页/共143页第42页/共143页THEENDREPLICATIONPROBLEM

TELOMERASEIfcellsdon'thavetelomerase,whathappenswithtelomeresaftermanycellsdivisions?第43页/共143页THEENDREPLICATIONPROBLEM

第44页/共143页第44页/共143页端粒酶延长端粒DNA

第45页/共143页端粒酶延长端粒DNA第45页/共143页Inchwornmodel第46页/共143页Inchwornmodel第46页/共143页第47页/共143页第47页/共143页TelomereT-loop第48页/共143页TelomereT-loop第48页/共143页Telomeresarepackagedintoauniquestructure--aT-loop第49页/共143页TelomeresarepackagedintoaGreen=Telomere-specificproteinsT-loopseenintheelectronmicroscope第50页/共143页Green=T-loopseen第50页/共143页TelomeresStructuralelementsofaeukaryoticchromosome(5')(TxGy)n(3')(AxCy)nTheTxGystrandintelomeresfoldsbackuponitself,formingGquadruplexes.Metalion(K+)bindingisrequiredtoformastablestructure.第51页/共143页TelomeresTheTxGystrandinteTelomeres

Structuralelementsofaeukaryoticchromosome(5')(TxGy)n

(3')(AxCy)nJ.MolBiol.(2002),320,911-924第52页/共143页Telomeres

StructuralelementsTelomeresJ.MolBiol.(2002),320,911-924第53页/共143页TelomeresJ.MolBiol.(2002),第54页/共143页第54页/共143页第55页/共143页第55页/共143页

端粒酶活性的测定

端粒酶的特殊性使端粒酶活性的测定在研究中显得尤为重要。基本测定方法是通过测定细胞提取物将端粒重复片段加到一个合成的寡聚脱氧核苷酸引物3′端的能力进行的。（1）TRAP法模拟端粒结构设计单链DNA引物TS，端粒酶催化加上6核苷酸重复序列，然后用重复序列互补引物CX对合成产物PCR扩增，电泳差6ntDNA条带。早期方法，只能定性。（2）TRAP-同位素图谱上述反应体系加入32P标记ATP，32P-TS引物，PCR扩增后电泳，放射自显影，扫描定量。第56页/共143页端粒酶活性的测定端粒酶的特殊性使端粒酶活性（3）TRAP-非同位素图谱组织裂解液稀释，TRAP法分析，溴乙锭染色根据6bp梯形条带在高低浓度出现，半定量分析。（4）PCR-ELISA法按TRAP法延伸引物，PCR扩增，与地高辛标记重复序列探针杂交，杂交产物通过生物素标记引物固定于抗生物素包被微孔板上，过氧化酶结合地高辛抗体检测PCR产物。产生有色产物，定量。（5）PCR-荧光法用荧光标记引物TS和CX，进行TRAP延伸、PCR、电泳。荧光分析定量。进行TRAP延伸、PCR，扩增产物结合能选择结合双链DNA的超敏荧光染料，测定电泳荧光强度，分析产生DNA量与端粒酶活性正比。半定量。第57页/共143页（3）TRAP-非同位素图谱第57页/共143页

端粒及端粒酶与衰老的关系第58页/共143页端粒及端粒酶第58页/共143页

端粒缩短是触发衰老的分子钟。大多数正常体细胞中不能检测到端粒酶的活性。端粒随细胞分裂每次丢失50-200个碱基。Cooke等认为，正常体细胞中端粒酶未被活化，导致端粒DNA缩短。可能最终制约细胞增殖能力。几千个碱基的端粒DNA丢失后，细胞就停止分裂而衰老。最有力的证据是Bodnar等的工作。将人端粒酶基因导入正常细胞，使端粒酶异常表达。端粒序列异常延长，细胞旺盛增殖，寿命大大延长。

第59页/共143页第59页/共143页第60页/共143页第60页/共143页TelomereLength(humans)NumberofDoublings2010Cellular(replicative)SenescenceNormalSomaticCells(TelomeraseNegative)Telomerealsoprovideameansfor"counting"celldivision:telomeresshortenwitheachcycleTelomeresshortenfrom10-15kb(germline)to3-5kbafter50-60doublings(averagelengthsofTRFs)Cellularsenescenceistriggeredwhencellsacquireoneorafewcriticallyshorttelomeres.第61页/共143页TelomereLength(humans)Number第62页/共143页第62页/共143页第63页/共143页第63页/共143页第64页/共143页第64页/共143页第65页/共143页第65页/共143页第66页/共143页第66页/共143页第67页/共143页第67页/共143页端粒缩短可引发细胞老化的机制可能有3种情况①端粒DNA的缩短释放了端粒结合转录因子，该因子进而激活衰老诱导基因或灭活细胞周期进行所必需的某些基因；②诱导DNA损伤的反应，导致细胞周期受阻；③端粒的缩短引起免疫功能下降，Pommier”早在1997年就观察到，受HIV感染的高度免疫缺陷病人外周血单核细胞的端粒长度急剧缩短。第68页/共143页端粒缩短可引发细胞老化的机制可能有3种情况①端粒DNA的缩大量的实验数据证明，端粒、端粒酶与衰老之间存在相关性。①在多数体细胞中，老年个体的端粒长度较年轻个体短的多，某些细胞如T、B淋巴细胞中的端粒酶活性随年龄的增加而下降。②年轻个体细胞中端粒酶活性随年龄的增长而下降。③需要无限分裂能力的谱系细胞、干细胞的端粒长度较长，且具有较高的端粒酶活性；而大多数具有有限增生能力的体细胞的端粒较短，不表达活性仅低度表达端粒酶活性。④增生能力强的细胞及永生细胞表达端粒酶活性，即使同一组织的不同部分，其分裂能力也与端粒酶的活性呈正比。⑤端粒酶阴性的细胞在引入端粒酶后，可维持端粒的长度，细胞增生能力加强，甚至细胞永生化第69页/共143页大量的实验数据证明，端粒、端粒酶与衰老之间存在相关性。第69TelomereLengthDeclines035651,5003,0008,000Age(years)Telomerelengthinbasepairs(humanwhitebloodcells)第70页/共143页TelomereLengthDeclines035651第71页/共143页第71页/共143页Telomeraseactivityisrepressedinsomaticcellsofmulticelluarorganismsresultinginagradualshorteningofthechromosomewitheachcellgeneration.AsthisshorteningreachesinformationalDNA,thecellssenesceanddie.细胞分裂端粒阈值第72页/共143页Telomeraseactivityisrepress

长短细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂端粒阈值端粒长短端粒酶活

Harley(1989)端粒的重复片段为探针检测胎儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株老年细胞株年龄小大端粒长度早老性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉”的衰老＞研究端粒（记时器）丢失的速率/年，预测人类的寿命

XXXYwhy?PCD机制、癌细胞的无限繁殖第73页/共143页长短细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂端Inmostsomatictissues,telomeraseisexpressedatverylowlevelsornotatall--ascellsdivide,telomeresshortenTelomeraseandSenescenceShorttelomeresmaybeasignalforcellstosenesce(stopdividing)第74页/共143页Inmostsomatictissues,telom

在早老患者中有一个过早的端粒缩短，进而缩短的端粒允许染色体融合，这些现象与年老患者的细胞中或培养的老化细胞中染色体组型衰老异常的高发生率密切相关。既然端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，使端粒在细胞复制过程中不会丢失，细胞衰老的进程也能被阻止，从而寿命延长——这正是人们研究的端粒酶与抗衰老关系的新热点。第75页/共143页在早老患者中有一个过早的端粒缩短，进而缩短的端粒允许

端粒酶延长端粒长度以减慢细胞衰老最早的证据来自Bodnar等的研究，1998年其在Science上刊文报道：将人的端粒酶基因导入端粒酶阴性的正常人体细胞中激活其表达并培养细胞，然后与未导入该基因的细胞比较，发现前者端粒明显增长，细胞分裂旺盛，细胞寿命比后者大大延长，更令人关注的是细胞并无肿瘤样改变。Kudo等报道端粒酶活性和细胞凋亡可作为伴有或不伴有子宫内发育延迟的胎盘衰老的标志。第76页/共143页端粒酶延长端粒长度以减慢细胞衰老最早的证据来自Bod

Mattson等亦认为在研究神经细胞分化和存活中激活端粒酶与TERT功能，能较好地避免神经细胞死亡，还可以促进神经细胞在各种神经元退化性病变条件下的恢复。阿尔茨海默病（Alzheimer`sdisease，AD）是一种常见于老年人的神经系统退化性疾病，其患者的脑血管壁中可分离出致AD神经元退行性病变的ß-淀粉样蛋白。

Zhu等利用反义技术和端粒酶抑制剂引发胎鼠海马区神经细胞中TERT的功能抑制，发现显著增加了由ß-淀粉样蛋白肽引起的细胞凋亡；嗜铬细胞瘤细胞中TERT的过量表达会降低此种细胞凋亡。

第77页/共143页Mattson等亦认为在研究神经细胞分化和存活中激活其原因是TERT功能降低的神经细胞在暴露于ß-淀粉蛋白中能增强其氧化性并使线粒体功能发生障碍，因而引起细胞凋亡。TERT在神经退行性病变实验模型中展现出有神经保护性功能，提示在神经细胞中若能提高端粒酶的活性可能会抑制与衰老相关的神经退行性病变，如AD和脑老化的发生等。第78页/共143页其原因是TERT功能降低的神经细胞在暴露于ß-淀粉蛋白中能增

端粒缩短加快可在许多病变中观察到:如Down综合征、Werner综合征、毛细管扩张失调症、先天性角化不良等,虽然有些遗传异常和端粒缺陷的关系还不清楚,但可能的原因有:①端粒核酸外切酶活性和(或)有效利用的增加。②端粒过度丢失。③在发育或出生后端粒补偿机制的不足(端粒酶或正性ALT样功能)。端粒缩短加速可由于环境的应急介导的DNA损害或对这些损害敏感度增加所致。不管何种原因,端粒缩短速率增加可致增殖组织的早衰特征,但也促进由于致瘤突变而获得增殖活性提高的克隆过分生长。

第79页/共143页端粒缩短加快可在许多病变中观察到:如Down综合第80页/共143页第80页/共143页第81页/共143页第81页/共143页

细胞的死亡过程分为两个阶段,当端粒缩短至一关键性长度2-4kb时,染色体的稳定性就会遭到破坏,细胞开始衰老进入M1期（mortalitystage1M1）。在M1期细胞对生长因子等失去反应，产生DNA合成蛋白抑制因子，细胞周期检查点（cellcyclecheckpoints）发送周期停止信号，DNA合成停止，DNA断裂,活化p53依赖或非p53依赖的DNA损伤途径。并诱导CDK抑制物如p21,p27产生,导致细胞G1期生长停滞,最终走向死亡。如果这一过程中一些癌基因SV40T抗原、PRB,或p53,p16等抑癌基因失活,丧失正常功能,

均能使M1期的机制被抑制使细胞逃逸M1期，继续生长获得额外的增殖能力，此时端粒酶仍为阴性，端粒继续缩短，经过20-30次分裂后，最终到达M2期。细胞由于端粒过短,基因不稳定,绝大多数细胞死亡,只有极少数细胞由于端粒酶活性的上调或重新激活,端粒的功能得到恢复,基因重获稳定,使细胞超越M2期,成为永生化细胞。

第82页/共143页细胞的死亡过程分为两个阶段,当端粒缩短至一关键性长第83页/共143页第83页/共143页

端粒酶被抑制正常人体细胞端粒丢失

M1期阻滞SV40T抗原细胞分裂停止Rb、P53与病毒蛋白结合、突变

↓

M1—M2期间隔永生化双着丝粒形成

↓

M2期退化染色体失稳端粒酶被激活

细胞凋亡

端粒酶在人体细胞永生性转化中第84页/共143页

端粒、端粒酶与肿瘤第85页/共143页端粒、端粒酶与肿瘤第85页/共143页

端粒酶活化是肿瘤的显著特征

尽管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非端粒酶依赖模式，即端粒替代延长（altematireLengtheningoftelomereALT）机制，但其存在上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。自从1994年Kim等创立TRAP法检测端粒酶活性以来，越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到。美国学者在400多例来源于12种不同组织的原发肿瘤病例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达84.8％，而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为4.4％。第86页/共143页端粒酶活化是肿瘤的显著特征第86页/共143页

附表人体组织中端粒酶活性肿瘤部位/类型与肿瘤邻近正常组织/良性病变肿瘤组织（%）肺3/68（4.4%）109/136（80.1%）乳腺2/28（7.1%）19/24（79.6%）前列腺1/18（5.6%）23/27（85.1%）结肠0/45（0）22/23（95.6%）肝——1/1（100%）卵巢0/8（0）7/7（100%）肾0/55（0）40/55（72.7%）神经母细胞瘤0/17（0）94/100（94%）血液（淋巴瘤，CLLALL）——21/23（91.3%）脑——6/8（75%）其它（头顶部，Wilms瘤）8/93（8.6%）24/26(92.3)合计14/332（4.2%）365/430(84.8)第87页/共143页附表人体组织中端粒酶活性肿瘤第88页/共143页第88页/共143页

Shay等报道了几年不同学者对肿瘤端粒酶探讨的检测结果，总结了正常组织（196例），原位癌（410例），恶性肿瘤（2031例）和癌旁组织（690例）的端粒酶的阳性率，它们分别是0.5%、30%、85%和11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的阳性率为85.0%～95.0%，而对应的癌旁或良性病变组织中，端粒酶基本上不能检出或活性极微弱。Sumida等的研究结果表明,端粒酶在各种肿瘤中的阳性率分别为:口腔鳞状细胞癌80%～90%,食道癌87%,胃癌85%,肺癌80.1%,肝癌85%,乳腺癌85%,肾癌71%,胰腺癌95%,端粒酶阳性率与肿瘤发生之间表现出良好的相关性。

第89页/共143页Shay等报道了几年不同学者对肿瘤端粒酶探讨的检测结

Orlando等对泌尿系统恶性肿瘤进行了深入的流行病学调查,结果发现肾癌组织中端粒酶阳性率为69%(345/497),正常肾组织为2%(7/344);膀胱癌组织中端粒酶阳性率为90%(342/381),正常组织为27%(36/134);膀胱癌患者尿液中端粒酶阳性率为65%(436/675),膀胱灌洗液中端粒酶阳性率为72%(131/182),而正常人为9%(47/486);前列腺癌组织中端粒酶阳性率为80%(266/332),邻近组织为38%(32/83),前列腺上皮瘤为16%(4/25),良性前列腺肥大为8%(11/129)。

第90页/共143页Orlando等对泌尿系统恶性肿瘤进行了深入

85%～90%的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性,而正常细胞中却没有或活性很低。人们推测肿瘤细胞逃避衰老持续增殖是端粒酶激活或端粒维持机制改变的结果。一般认为,端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中的一个后期事件,使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持,避免了细胞正常的复制-衰亡机制的制约而获得永生性,这是恶性肿瘤细胞显著的生物学特征之一,是癌变机制中一个十分重要的环节。第91页/共143页85%～90%的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶

对细胞端粒功能的观察和推测的最显著的特征是发生端粒长度的维持,甚至在离开常规的激活时端粒长度维持机制(TMM)的延长,使初期细胞突破衰老屏障后癌变。发生的原因,最可能为过度的端粒酶激活在细胞癌变中端粒长度的保留或增加,允许在致瘤突变发生时异常克隆的扩展。一些端粒酶阴性的癌症通过一种或几种ALT途经维持端粒的长度。端粒酶或ALT机制存在于绝大多数肿瘤细胞中以通过添加端粒重复序列而维持端粒的长度。在一些肿瘤中也观察到一些端粒缩短的现象，可能的机制是由于细胞分裂的增加端粒缩短，导致异常修复事件使染色体发生端端融合。端端融合的后果是在随后的细胞分裂过程中发生染色体断裂,进而导致遗传不稳定和肿瘤易感性。

第92页/共143页对细胞端粒功能的观察和推测的最显著的特征是发生端粒第93页/共143页第93页/共143页第94页/共143页第94页/共143页

以端粒酶为靶标的抗癌药物研究

在85%以上的肿瘤细胞和组织中高度表达端粒酶，因此端粒酶是一个较理想的抗肿瘤药物靶标。(1)使用端粒酶抑制剂后,肿瘤细胞端粒缩短直至足以对增殖产生负面效应,这种时间上的滞后与起始端粒的长度有关；(2)至少在理论上肿瘤细胞存在抗端粒酶抑制剂或不依赖端粒酶的端粒维持机制的可能；(3)端粒酶抑制剂对人表达端粒酶的体细胞可能有作用,例如造血干细胞、生殖细胞、表皮基层细胞和肠腺管细胞,但这种作用可能很小,因为新生组织的干细胞比肿瘤细胞的端粒要长得多。在细胞静止期,端粒不缩短,端粒酶几乎没有活性。第95页/共143页以端粒酶为靶标的抗癌药物研究第95页/共143页

端粒酶抑制剂对肿瘤细胞和端粒酶阳性的正常细胞的作用是不同的:肿瘤细胞对端粒酶抑制剂很敏感,作用一定时间后细胞出现生长抑制或凋亡;

生殖细胞在端粒酶抑制剂的作用下,端粒长度稍有缩短,然后继续生长,端粒不再缩短;

干细胞与端粒酶阴性的细胞相比,其端粒缩短的速度慢得多,经端粒酶抑制剂作用后,干细胞中端粒缩短的速度有所加快,一旦去除抑制剂,端粒缩短的速度又降低。

第96页/共143页端粒酶抑制剂对肿瘤细胞和端粒酶阳性的正常细胞的作用是端粒酶抑制剂的研究进展一、以端粒酶酶RNA为靶标通过阻断端粒酶RNA的模板作用对端粒酶活性的抑制

1、反义寡核苷酸是端粒酶抑制剂研究领域中的热点,它是与靶RNA配对的一段短链DNA。按碱基配对原理与靶RNA形成杂合体,被动和主动地抑制RNA的转录。

2、核酶对端粒酶活性的抑制，核酶是具有特殊核酸内切酶活性的小分子RNA，通过催化中心的反义序列识别靶位。核酶有望成为广谱，低毒，高效的抗癌新药。

第97页/共143页端粒酶抑制剂的研究进展第97页/共143页二、抑制端粒酶逆转录酶活性1、hTERT突变在体内和体外实验中,hTERT突变后端粒酶活性均明显被抑制。端粒酶抑制剂诱导端粒进行性缩短,当细胞端粒缩短到临界点时细胞进入凋亡期。2、逆转录酶抑制剂(reversetranscriptaseinhibitors,RTI)由于端粒酶是RNA依赖的DNA聚合酶,所以RTI可以成为肿瘤治疗药物。其中对于齐多夫定的研究最多。3、靶向hTERTmRNA的ASODN

针对hTERTmRNA设计的ASODN能选择性地与靶基因杂交,阻断靶基因的表达。第98页/共143页二、抑制端粒酶逆转录酶活性第98页/共143页第99页/共143页第99页/共143页第100页/共143页第100页/共143页第101页/共143页第101页/共143页第102页/共143页第102页/共143页三、G四联体的稳定端粒3′端突出链富含鸟苷,在体外可形成四链DNA结构,称为G四联体。形成G四联体后端粒酶活性受到抑制。因此,能稳定G四联体的药物就可能是有效的端粒酶抑制剂。已发现很多此类化合物,这些药物可以抑制端粒酶,但尚无缩短端粒的报道。四、小分子抑制剂通过分子结构模拟软件进行拟合分析，或通过其他高通量模式快速筛选端粒酶的小分子抑制剂是近年来发展较快的一个领域,此方法是基于化学结构的生物信息学策略去搜寻先导化合物,用这一策略已发现了几个端粒酶抑制剂(例如FJ5002),但其作用机制尚不清楚。

第103页/共143页三、G四联体的稳定第103页/共143页Lietal,CancerRes2004;Lietal,2005;Bagherietal2006

Telomeraseknock-downincancercells

RAPIDLYinhibitscancercellgrowth

p53isnotrequiredforthis

NOtelomereuncappingorDNAdamageresponse

MetastasisisreducedHOW?RAPIDLYdownregulatescellcycleandtumorprogressiongenesGlucosemetabolismdownregulatedCelldifferentiationprograminduced?第104页/共143页Lietal,CancerRes2004;LiVeryshorttelomeresleadtochromosomalinstabilitybycyclesofBRIDGE–BREAKAGE–FUSION第105页/共143页VeryshorttelomeresleadtocAnaphasebridgesEnd-to-endfusionTelomereshortening123VIDEODicentricchromosomeinametaphasespreadofcellsfromahumanpancreaticcarcinomacellline(centromesinpink)第106页/共143页Anaphasebridges第107页/共143页第107页/共143页MOREcelldivisionssenescenceWithmoretelomerase,

lesslossofDNAeachcelldivision第108页/共143页MOREcelldivisionssenescencecell

divisionsFastersenescenceWithlesstelomerase,

morelossofDNAeachcelldivision第109页/共143页celldivisionsFastersenescencTelomeresandDiseaseCAD,MyocardialInfarctionDiabetesVasculardementiaObesity,insulinresistanceAlzheimersDiseaseRheumatoidArthritisBoneDensitySamanietal,Lancet,2001;Brouiletteetal,2003;ArteriosclerThrombVascBiol2003;Sampson,2006,DiabetesCare;vonZglinicki,2000,LabInvest.Jeanclosetal,2000,Hypertension;Valdesetal,.Lancet2005;Gardner,2005,Circulation;Valdesetal,2006,OsteoporosisInt.Steeretal.,2007AnnalsRheumDisease;Cawthon,2003,Lancet第110页/共143页TelomeresandDiseaseCAD,Myoc第111页/共143页第111页/共143页ThreeMarkersofCellularAging

TelomeraseactivityTelomerelengthCellularOxidativestressPsychologicalStress,RisksofCardiovascularDiseaseandTelomeres/Telomerase/OxidativeStress第112页/共143页ThreeMarkersofCellularAginTelomeremaintenanceandriskofcardiovasculardiseaseInthelargestepidemiologicalstudyofriskfactorsforcardiovasculardisease,sixprominentfactorswereshowntobe:

smokingpoorlipidprofilehighbloodpressurediabetesabdominalobesitypsychologicalstress(Yusefetal,Lancet2004:304).Alinkinvivo第113页/共143页TelomeremaintenanceInthelaInthelargestepidemiologicalstudyofriskfactorsforcardiovasculardisease,sixprominentfactorswereshowntobe:

smokingpoorlipidprofilehighbloodpressurediabetesabdominalobesitypsychologicalstress(Yusefetal,Lancet2004:304).ChronicstresswasassociatedwiththreemarkersofcellularagingLowertelomeraseactivityHigheroxidativeindexShortertelomerelengthTelomeremaintenanceandriskofcardiovasculardisease*Epeletal,2004*Alinkinvivo第114页/共143页InthelargestepidemiologicalInthelargestepidemiologicalstudyofriskfactorsforcardiovasculardisease,sixprominentfactorswereshowntobe:

smokingpoorlipidprofilehighbloodpressurediabetesabdominalobesitypsychologicalstress(Yusefetal,Lancet2004:304).smokingcholesterol/bloodlipidsrestingcardiovascularactivityfastinginsulinandglucoseadipositypsychologicalstressChronicstresswasassociatedwiththreemarkersofcellularagingLowertelomeraseactivityHigheroxidativeindexShortertelomerelengthTelomeremaintenanceandriskofcardiovasculardisease*Epeletal,2004*Alinkinvivo第115页/共143页InthelargestepidemiologicalInthelargestepidemiologicalstudyofriskfactorsforcardiovasculardisease,sixprominentfactorswereshowntobe:

smokingpoorlipidprofilehighbloodpressurediabetesabdominalobesitypsychologicalstress(Yusefetal,Lancet2004:304).smokingcholesterol/bloodlipidsrestingcardiovascularactivityfastingglucoseadipositypsychologicalstressStresswasassociatedwiththreemarkersofcellularagingLowertelomeraseactivityHigheroxidativeindexTelomerelengthTelomeremaintenanceandriskofcardiovasculardisease*Epeletal,2006Alinkinvivo第116页/共143页InthelargestepidemiologicalExample:Telomeraseandwhether

currentlysmokingp<.0001SmokersNon-smokersNon-smokersSmokersTelomeraseactivitypercell第117页/共143页Example:Telomeraseandwhethe第118页/共143页第118页/共143页第119页/共143页第119页/共143页问题与展望

一、问题1、检测方法在临床的可操作性及稳定性；2、缺乏灵敏度和特异性高的定量准确的检测方法；3、端粒和端粒酶新组分的克隆和鉴定；4、肿瘤细胞的端粒维持及调控机制；5、端粒酶动力学、端粒酶作用及调控的确切机制。6、部分肿瘤细胞有较长的端粒（>10kb）,随细胞有丝分裂，端粒缩短是个缓慢的过程，这种情况下端粒酶抑制剂是否有效尚待进一步证实。

第120页/共143页问题与展望第120页/共143页二、研究展望

大量实验表明，端粒酶可有效地调控端粒的长度，而端粒的长度直接对细胞的增殖或凋亡起作用，从而决定人体寿命的长短。随着对端粒、端粒酶结构和端粒酶激活及调节机制的深入研究,端粒酶与人类衰老和肿瘤发生、发展的关系将进一步明确;

如何将端粒酶检测作为肿瘤诊断标记仍是今后研究的方向。同时进一步探讨端粒、端粒酶和衰老因素、长寿因素之间的关系，以及开展克隆人端粒基因等科研课题对于研究人体衰老与抗衰老有着十分重要的意义。第121页/共143页二、研究展望第121页/共143页谢谢！第122页/共143页谢谢！第122页/共143页第123页/共143页第123页/共143页第124页/共143页第124页/共143页第125页/共143页第125页/共143页第126页/共143页第126页/共143页第127页/共143页第127页/共143页第128页/共143页第128页/共143页第129页/共143页第129页/共143页第三节端粒酶细胞周期中细胞增殖、凋亡的影响

一、端粒酶对细胞周期的影响

端粒酶活性与细胞周期密切相关。细胞周期所处阶段不同,端粒酶活性亦不同,端粒酶活性与细胞周期CDK-CKIs网络调控系统有关

。实验发现永生化细胞株在细胞周期各个时相都有端粒酶活性,而静息细胞中活性降低,随着肿瘤细胞进入G1/S期,端粒酶活性逐渐升高,在复制S期端粒酶活性最高,而在G2/M期端粒酶活性逐渐丧失,当培养细胞处于无血清而进入G0期时,端粒酶活性不受影响。在人乳腺癌中,端粒酶的高活性水平伴有cylinD或cyclinE的高表达,某些周期蛋白可能参与端粒酶活性的调控。第130页/共143页第三节第130页/共143页

各种基因毒性或环境应激所致细胞DNA双链破坏时可使野生型p53活化,进而引起细胞周期停滞或诱导细胞凋亡,使细胞得以避免表型恶性转化。端粒双链DNA的破坏是否也能活化p53依赖的信号传导通路呢?kusumoto等在构建的端粒酶和p53单或双缺陷鼠体内研究证实,端粒DNA的丢失可以诱导活化p53和p21WAF1,并导致细胞周期停滞，而p53的缺失则可促进端粒序列的丢失,增大染色体的融合频率。端粒功能的缺失以及相继出现的基因不稳定与p53缺陷相协同而激活细胞恶性转化过程。第131页/共143页各种基因毒性或环境应激所致细胞DNA双链破坏二、端粒酶对细胞增殖的影响

曾一度认为端粒酶活性是细胞恶变或永生的标志,然而,不但在正常组织的永生化细胞(如造血干细胞、精子),而且在非永生的、正常生理状态下增殖活跃的细胞(如受抗原刺激的T及B淋巴细胞、口腔和食道粘膜上皮、皮肤基底层角质形成细胞、宫颈上皮、小肠上皮)也可检出端粒酶活性。但Lehner等用定量RT-PCR法在子宫内膜癌、增生期子宫内膜、分泌期子宫内膜及萎缩性子宫内膜检测到hTERTmRNA表达值差异显著。可见,不同增殖程度的子宫内膜均表达端粒酶活性,但其程度不同。因此,借助端粒酶定性检测判断良恶性增殖,其意义明显不如定量检测。第132页/共143页二、端粒酶对细胞增殖的影响第132页/共143页

已有多次报道:改变实验条件可使多种端粒酶活性阴性细胞表达端粒酶活性,并获得永生;反之,抑制某些增殖活跃组织的端粒酶活性能抑制细胞增殖。另有人发现:端粒酶通过调节端粒长度和生长促进因子基因表达来影响细胞增殖

。提示端粒酶是细胞生长、增殖中的重要机制。

第133页/共143页已有多次报道:改变实验条件可使多种端粒酶活性

但少数永生化的肿瘤细胞株和一些软组织肿瘤虽然没有端粒酶活性,但仍有较长端粒,提示还存在不依赖端粒酶的端粒延长机制。此外用识别hTR3′端不同序列的三种核酶作用于肿瘤细胞,4周内端粒酶活性降低,端粒缩短,增殖速度没有改变。其他研究如黑素瘤细胞,8周内端粒酶活性降低,但是传代超过20代后,端粒长度不缩短,细胞持续增殖。说明除了端粒、端粒酶引起细胞增殖的作用外，还有其他引起细胞的增殖机制。第134页/共143页但少数永生化的肿瘤细胞株和一些软组织肿瘤虽然三、端粒酶对细胞凋亡的影响

启动凋亡的某些基因位于端粒结构附近,完整的端粒结构可以抑制这些基因的表达,而维持端粒长度主要依赖于端粒酶。

Holt等在实验中发现,通过异位表达端粒酶,而使端粒长度保持稳定的某些正常细胞对凋亡的抵抗力增强；用实验方法使端粒酶阳性细胞端粒延长,子代细胞生存和抗凋亡能力将增强；端粒酶阳性永生化细胞要比端粒酶阴性永生化细胞有更强的抗凋亡生存能力。这些与两个主要的凋亡途径—核内钙依赖核酸内切酶诱导途径和Caspese家族中IL-1B转换酶活化途径存在缺陷有关。此外,研究发现诱导hTERT显性突变,降低肿瘤细胞内源性端粒酶活性,肿瘤细胞端粒将持续缩短,继之异常有丝分裂增多,并最终出现大量凋亡细胞。第135页/共143页三、端粒酶对细胞凋亡的影响第135页/共143页谢谢！第136页/共143页谢谢！第136页/共143页端粒端粒是位于真核细胞线性染色体末端的特殊结构,由一段重复串联的DNA序列与端粒结合蛋白构成；端粒具有稳定染色体,防止末端降解和融合的功能；端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而变短,端粒DNA逐渐变短而消失,可导致染色体稳定性下降并导致衰老。第137页/共143页端粒端粒是位于真核细胞线性染色体末端的特殊结构,由伊丽莎白•布兰克波恩、卡罗尔•格雷德、杰克•绍斯塔第138页/共143页伊丽莎白•布兰克波恩、卡罗尔•格雷德、杰克•绍斯塔第1Telomeresarepackagedintoauniquestructure--aT-loop第139页/共143页TelomeresarepackagedintoaTelomeraseactivityisrepressedinsomaticcellsofmulticelluarorganismsresultinginagradualshorteningofthechromosomewitheachcellgeneration.AsthisshorteningreachesinformationalDNA,thecellssenesceanddie.细胞分裂端粒阈值第140页/共143页Telomeraseactivityisrepress第141页/共143页第141页/共143页第142页/共143页第142页/共143页问题与展望

一、问题1、检测方法在临床的可操作性及稳定性；2、缺乏灵敏度和特异性高的定量准确的检测方法；3、端粒和端粒酶新组分的克隆和鉴定；4、肿瘤细胞的端粒维持及调控机制；5、端粒酶动力学、端粒酶作用及调控的确切机制。6、部分肿瘤细胞有较长的端粒（>10kb）,随细胞有丝分裂，端粒缩短是个缓慢的过程，这种情况下端粒酶抑制剂是否有效尚待进一步证实。

第143页/共143页问题与展望第143页/共143页会计学144端粒端粒酶第1页/共143页会计学1端粒端粒酶第1页/共143页端粒端粒是位于真核细胞线性染色体末端的特殊结构,由一段重复串联的DNA序列与端粒结合蛋白构成；端粒具有稳定染色体,防止末端降解和融合的功能；端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而变短,端粒DNA逐渐变短而消失,可导致染色体稳定性下降并导致衰老。第2页/共143页端粒端粒是位于真核细胞线性染色体末端的特殊结构,由

端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸－蛋白复合体,其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。端粒酶是一种核酸核蛋白酶,能以自身的RNA为模板合成端粒的重复序列,以维持端粒长度的稳定性。许多研究表明,端粒、端粒酶的功能失调将影响细胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细胞增殖、癌变、凋亡、衰老。

第3页/共143页端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。第3页/第4页/共143页第4页/共143页●端粒的发现

1938MullerX-rayDrosophila

末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定.并定名为Telomere

1938B.McClintock

顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。推测染色体末端具有特殊端粒结构。七十年代端粒分子组成确定八十年代端粒酶的发现九十年代端粒酶与细胞衰老、癌症的关系二零零九年诺贝尔奖第5页/共143页●端粒的发现1938Muller末端极少发生缺失和伊丽莎白•布兰克波恩、卡罗尔•格雷德、杰克•绍斯塔第6页/共143页伊丽莎白•布兰克波恩、卡罗尔•格雷德、杰克•绍斯塔第6端粒的结构与功能第7页/共143页端粒的结构与功能第7页/共143页第8页/共143页第8页/共143页ChromosomeDNAGene1Gene2TelomeresTelomeresTTAGGG第9页/共143页ChromosomeDNAGene1Gene2Telom第10页/共143页第10页/共143页1.端粒的组成

端粒DNA与端粒结合蛋白端粒DNA

重复:

端粒DNA由高度重复短核苷酸序列组成。人：-TTAGGG-重复序列

保守：