DB15T 2594-2022紫花苜蓿组织培养技术规程

ICS65.020.20CCSB21ICS65.020.20CCSB21内蒙古自治区地方标准DB15/T2594—2022紫花苜蓿组织培养技术规程Technicalcodeofpracticefortissuecultureofmedicagosativa2022-06-242022-06-242022-07-24内蒙古自治区市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古农业大学。本文件主要起草人：徐春波、王勇、赵海霞。紫花苜蓿组织培养技术规程范围本文件规定了紫花苜蓿组织培养的术语与定义、培养基、外植体、愈伤组织诱导培养、增殖培养、分化培养、生根培养、炼苗与移栽等基本内容及技术要求。本文件适用于紫花苜蓿组织培养育苗。（GB/T603NY/T2306花卉种苗组培快繁技术规程DB15/T1940NY/T2306界定的术语和定义适用于本文件。NY/T2306界定的术语和定义适用于本文件。紫花苜蓿medicagosativaL.属于豆科（Leguminosae）苜蓿属（Medicago）多年生草本植物。4环境与器具灭菌按照DB15/T1940操作。5培养基MS培养基、1/2MS、改良SH培养基和MSO培养基见附录A。5.2.1配制将常用试剂配制成50～100倍的母液，严格按照GB/T603规定方法配制。所用激素均配制浓度为0.5mg/mL，配制方法详见附录B。5.2.2保存4℃的冰箱3配制配置1L600ml～700ml7.525g1LpH用1mol/L的NaOH将配制好的培养基调到pH值5.8～6.0，用酸度计或精密pH试纸测定。1/4～1/31220mi6外植体753mi～5in1010i15in，无菌水冲洗5～6次后用灭菌的滤纸吸干种子表面的液体，接种到1/2MS培养基上。取7d～10d15d～20d3mm～5mm长的小块或小段。7愈伤组织诱导培养培养基诱导培养基为改良SH+2.0mg/L2，4-D+0.5mg/L6-BA。接种2.5cm2～3cm21培养条件白天25℃、晚上18℃，每天光照时间16h，光照强度1000Lux～2000Lux。培养时间培养20d～30d。培养基增殖培养基1为MSO+0.5mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LAgNO3。增殖培养基2为MS+0.3mg/LTDZ。接种4cm2～5cm21培养条件按照7.3进行。培养时间增殖培养基1培养14d～20d，移到增殖培养基2继续培养5d～7d，之后再移至增殖培养基1培养10d～15d。培养基分化培养基为MS+0.2mg/LKT。分化培养基为MS+0.2mg/LKT。接种5cm2～6cm21培养条件按照7.3进行。培养时间培养40d～50d；每20d换1次培养基。10生根培养培养基生根培养基为1/2MS。接种cm～5cm按照7.3进行。培养20d～30d。11炼苗与移栽炼苗选择生长健壮的组培苗，打开封口膜，放在自然光、室温下2d～3d。基质土:草碳:蛭石3:2:1混合。高压灭菌后装入花盆备用。移栽取出组培苗，洗掉培养基，栽入花盆，浇水，放入温室，适当保温，常规管理。待苗长至20cm～30cm移栽至大田。附录A（）基本培养基成分见表A.1。表A.1基本培养基成分类型组分MS培养基改良SH培养基MSO培养基大量元素KNO31900.02830.01900.0NH4NO31650.0463.01650.0MgSO4·7H2O370.0185.0370.0KH2PO4170.0400.0170.0CaCl2·2H2O440.0166.0440.0微量元素MnSO4·4H2O22.300----22.300ZnSO4·7H2O8.6008.6008.600H3BO36.200----6.200KI0.830----0.830Na2MoO4·6H2O0.2500.2500.250CuSO4.5H2O40.0250.0250.025CoCl2.6H2O0.0250.0250.025铁盐Na2-EDTA37.3037.3037.30FeSO4.7H2O27.8027.8027.80有机物甘氨酸2.000--------盐酸吡哆辛0.5009.5001.000盐酸硫铵素0.1009.90010.000烟酸0.500----1.000肌醇100.000----100.000尼克酸----4.500----附录B（规范性）激素的配制激素的配制见表B.1。表B.1激素的配制类别名称配制方法灭菌方式存储方式生长素2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）用适量无水乙醇溶解后加入去离子水定容。高温灭菌冷藏（4℃），密封，避光保存萘乙酸（NAA）细胞分裂素6-苄基嘌呤（6-BA）0.1M（HCL）解后加入去离