分子生物学课件：基因敲除

基因的生物学功能鉴定技术

复旦大学复旦大学复旦大学基因的生物学功能鉴定技术复旦大学复旦大学复旦大学第一节转基因技术第二节基因敲除技术第三节RNA干涉基因功能的鉴定技术第一节转基因技术基因功能的鉴定技术基因敲除(geneknock-out)基因敲除(geneknock-out)属于基因打靶技术的一种，利用同源重组的原理，在ES细胞中定点破坏内源基因，然后利用ES细胞发育的全能性，获得带有预订基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯合个体。概念*（*为教学重点）基因敲除(geneknock-out)基因敲美国犹他大学Eccles

人类遗传学研究所

马里奥·卡佩奇Mario

R.

Capecchi英国卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院马丁·埃文斯Martin

J.

Evans美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院奥利弗·史密斯Oliver

Smithies基因敲除技术发展及成果1989年成功对一只老鼠进行基因打靶

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2007MarioR.CapecchiSirMartinJ.EvansOliverSmithies美国犹他大学Eccles

人类遗传学研究所

马里奥2.基本原理利用DNA同源重组的原理，在活体内将特定基因从染色体上剔除的过程。GenomicDNA:TargetingDNAfragment:GenomicDNA/geneknockedout:LostitsoriginalfunctionHomologousarmsequence2.基本原理利用DNA同源重组的原理，在活体内将特定基因从3.操作流程*

将基因敲除载体导入ES细胞：重组置换＊用选择培养基筛选已击中的细胞﹔将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物（缺失的杂合子小鼠）。

构建基因敲除载体通过杂合子后代交配，获得纯合子基因敲除小鼠；对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。3.操作流程*将基因敲除载体导入ES细胞：重组置换＊用构建基因敲除载体基因敲除载体的特点：待敲除基因的同源臂序列阳性筛选标记基因（NeoR)阴性筛选标记基因

(TK

gene)PTargetingvector打靶载体问题：如何构建打靶载体？PositivescreeningmarkergeneHomologousarmsHSV-TkgeneNeoRestrictionenzyme打靶载体PTargetingvector

LinearizethetargetingvectorHomologousarmsofgenewaitingforbeingknockedoutNegativescreeningmarkergene:TKgeneNeoR*HSV-TK构建基因敲除载体基因敲除载体的特点：待敲除基因的同源臂序列P>基因敲除载体的构建过程：待敲除基因PCloningvectorPRecombinantcloningvectorPRecombinantcloningvectorNeoRgenePRecombinantcloningvectorPRecombinantcloningvectorTkgenePTargetingvector将待敲除基因切除大部分使其失活，留下用于重组的同源臂同源序列中间插入了NeoR基因构建打靶载体在同源臂的外侧线性化载体>基因敲除载体的构建过程：待敲除基因PCloningvecEScellPTargetingvectorRestrictionenzymeHomologousarmsHSV-TkNeo如何筛选出同源重组的ES细胞呢？2.将基因敲除载体导入ES细胞：重组置换＊小鼠受精卵发育第3～5天（分裂至8个细胞左右）时的胚泡细胞；能在体外培养，具有发育的全能性。EScellPTargetingvectorRestriES细胞中同源重组的示意图同源重组在哺乳动物细胞中发生的概率（10-5），一个合适的筛选方法对于减小工作量是十分必要的。如何筛选出同源重组的ES细胞呢？ES细胞中同源重组的示意图同源重组在哺乳动物细胞中发生的概率PTargetingvector打靶载体NeoR阳性筛选标记基因（NeoR)抗新霉素抗药基因。G418是一种和新霉素结构相似的抗生素。G418可以筛选所有能表达neo基因的细胞。阴性筛选标记基因

(TK

gene)HSV-TK基因的表达产物是胸苷激酶，此酶能分解单核苷酸类似物，并且分解产物是有毒性的。普通细胞因无TK基因

，可在含单核苷酸类似物的培养基中生长。如果Tk基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡HSV-TK正负筛选系统筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？PTargetingvector打靶载体NeoR阳性筛选标1.同源重组HSV-TkNeo

EScellsP53gene正负筛选系统工作原理P53gene10-5-10-6NeogeneNeor基因进入ES细胞的基因组P53基因被替换在G418、单核苷酸类似物的培养基中，可以存活。2.随机插入，非同源重组P53geneNeogeneHSV-TkP53geneNeor基因和HSV-TK基因同时进入ES细胞的基因组在G418培养基中存活，但是含有单核苷酸类似物培养基中死亡。P53基因没有被替换1.同源重组HSV-TkNeoEScellsPPositive-negativeselectionHomologousrecombinantsG418

Neomycin(positiveselection)killsthenon-insertions;Gancyclovir(negativeselection)killstherandominsertionsInsurvivalcells,P53geneisreplacedbyNeo.MediumwithG418&GancyclovirNormalEScellsTransfectionPositive-negativeselectionHom3.利用ES细胞发育的全能性，将一条染色体上特定基因失活的ES细胞发育成特定基因敲除的小鼠。???A.基因敲除ES细胞注射入胚泡B.嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中C.嵌合体小鼠的繁育，获得杂合子小鼠D.杂合子小鼠交配，获得基因敲除的纯合子小鼠3.利用ES细胞发育的全能性，将一条染色体上特定基因失活3A.基因敲除的ES细胞被注射入胚泡。Mate3days.ProvidestheblastocystwithnormalEScell

InjectChimericBlastocystoriginalinnercellmassNormalMouseembryo嵌合胚泡3A.基因敲除的ES细胞被注射入胚泡。Mate3days3B.嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中嵌合体小鼠一些器官有些细胞来自于囊胚，有些来自于ES,就会产生嵌合现象。皮肤细胞：囊胚（黄色），ES（黑色）黑细胞和黄细胞之间的基因组在任何单个细胞内并没有交集嵌合体小鼠带着两套完全不同的基因组。3B.嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中嵌合体小鼠一些器官有些细胞来3C.嵌合体小鼠的繁育，获得杂合子小鼠♀♂Mate正常小鼠嵌合体小鼠杂合子小鼠杂合子小鼠：一条染色体P53基因突变；另一条染色上基因是野生型的。正常小鼠1／2Heterozygousmice如果嵌合体小鼠的生殖细胞是由基因敲除的ES细胞发育成的。所有细胞都是3C.嵌合体小鼠的繁育，获得杂合子小鼠♀♂Mate正常小3D.杂合子小鼠交配，获得基因敲除的纯合子小鼠♂♀Mate1／4纯合子基因敲除小鼠3D.杂合子小鼠交配，获得基因敲除的纯合子小鼠♂♀Mat小结：基因敲除的操作流程

*嵌合体杂合子小鼠基因敲除的纯合子小鼠与阴性小鼠交配123A3B3C3D小结：基因敲除的操作流程*嵌合体杂合子小鼠基因敲除的纯合上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活，但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR),该基因会影响机体正常的功能。怎么改进？扩展知识：有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体,

针对这类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活，条件性基因敲除*将某个基因修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。

条件性基因敲除*将某个基因修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或条件性基因敲除Cre/loxp系统利用可诱导性启动子和Cre重组酶特异性识别位点构建基因敲除载体，通过诱导剂实现可控性基因敲除。两个要素：Cre重组酶诱导型启动子条件性基因敲除利用可诱导性启动子和Cre重组酶特异性识别位点一种343个氨基酸组成的单体蛋白质，属于位点特异性重组酶。从噬菌体P1提取获得。特异性识别loxp序列，可以引发loxP位点的DNA重组。一段长34bp的DNA序列，含有两个13bp的反向重复序列和一个8bp的核心序列。这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点。Cre重组酶和loxp序列13bp13bp8bp这8bp的序列决定Loxp位点的方向Cre结合位点Cre结合位点

核心序列一种343个氨基酸组成的单体蛋白质，属于位点特异性重组酶。CCre重组酶介导的重组方式1.回顾一下同源序列同源重组Cre重组酶介导的重组方式1.回顾一下同源序列同源重组Loxp是一段34bp长的回文序列，在两段反向重复的13bp片段之间有8bp的间隔序列，这8bp的序列决定Loxp位点的方向。TATTGAAGCATAT

CGTATGTA

ATATGCTTCAATAATAACTTCGTATA

GCATACAT

TATACGAAGTTATTATTGAAGCATAT

CGTATGTA

ATATGCTTCAATAATAACTTGCTATA

GCATACAT

TATACGAAGTTAT方向一致TATTGAAGCATAT

CGTATGTA

ATATGCTTCAATAATAACTTGCTATA

GCATACAT

TATACGAAGTTATTATTGAAGCATAT

CGTATGTA

ATATGCTTCAATAATAACTTGCTATA

GCATACAT

TATACGAAGTTAT同源重组Cre重组酶介导的重组方式Loxp是一段34bp长的回文序列，在两段反向重复的13bpCre重组酶和loxp序列Cre重组酶和loxp序列Cre/LoxP重组系统：---特定阶段敲除基本策略：使待敲除基因位于两个LoxP位点之间。loxP位点被引入到相应基因的内含子内，胚胎发育期间不会影响相应基因的功能。特定阶段：Cre酶切割靶基因。Cre/LoxP重组系统：---特定阶段敲除基本策略：Cre/LoxP重组系统基因敲除的原理*基本策略：使待敲除基因位于两个LoxP位点之间Cre重组酶的可控性表达Cre/LoxP重组系统基因敲除的原理*基本策略：采用胚胎干细胞技术获得转基因小鼠（1）转基因表达载体的构建在体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位点的基因敲除载体（2）将体外构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞

基因敲除载体通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列。（3）将转基因ES细胞或受精卵细胞移植胚泡中，将转基因胚泡移植入假孕小鼠的子宫腔中（4）鉴定并筛选转基因小鼠1.如何构建靶基因被两个LoxP位点锚定的转基因小鼠采用胚胎干细胞技术获得转基因小鼠1.如何构建靶基因被两个Lo（1）条件性基因敲除载体的构建基因敲除载体的结构是：4NeoLoxPLoxPLoxPTK如果基因组序列是：1234待敲除基因1.如何构建靶基因被两个LoxP位点锚定的转基因小鼠（1）条件性基因敲除载体的构建基因敲除载体的结构是：4Neo基本流程：条件性基因敲除载体的构建在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除12344NeoLoxPLoxPLoxPTK1234NeoLoxPLoxPLoxPHomologousrecombinationGenomicDNA:使待敲除基因位于两个LoxP位点之间基本流程：12344NeoLoxPLoxPLoxPTK123使待敲除基因位于两个LoxP位点之间基本流程：条件性基因敲除载体的构建在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除在ES细胞中敲除Neo基因1234NeoLoxPLoxPLoxPCreexpressiongenewastransientlyintroducedintotargetedEScellsCre1234LoxPLoxP左右Loxp突变体(Lox71/Lox66)使待敲除基因位于两个LoxP位点之间基本流程：1234Neo靶基因被两个LoxP位点锚定的转基因小鼠靶基因被两个LoxP位点锚定的转基因小鼠,称为loxp

floxed小鼠。“loxPfloxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，“loxp”小鼠表型仍同野生型的一样。靶基因的修饰(切除)是以Cre的表达为前提的。只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。靶基因被两个LoxP位点锚定的转基因小鼠靶基因被两个LoxP2.如何构建Cre重组酶的转基因小鼠Cre重组酶的可控性表达第二只小鼠采用胚胎干细胞技术获得。在这只小鼠中，Cre重组酶被置于某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定的条件下表达。在这种小鼠的体内，Cre重组酶可在特定组织内进行可控性表达。2.如何构建Cre重组酶的转基因小鼠Cre重组酶的可控性表达Cre重组酶的可控性表达使Cre基因位于可诱导性启动子下游：TRECreinducerON红色的半圆圈为：四环素阻遏蛋白（TetR）圆圈：_诱导剂：四环素当四环素存在时，TetR构象发生改变，基因表达Cre重组酶的可控性表达使Cre基因位于可诱导性启动子下游Cre重组酶的可控性表达构建可诱导性表达-组织特异性基因敲除系统使Cre基因位于可诱导性启动子下游：TRECreCreinducerONCreCreCre1234LoxPLoxPCreCreCreCre123LoxP利用控制Cre表达的启动子的活性，通过对诱导剂给予时间的控制。从而在1oxP动物的一定发育阶段实现对特定基因进行遗传修饰。Cre重组酶的可控性表达构建可诱导性表达-组织特异性基因敲除构建可诱导性表达-组织特异性基因敲除系统Cre重组酶的可控性表达rtetRTissue-specificpromoterrtetRtetTRECreON1234LoxPLoxPCreCreCreCreTeT阻遏蛋白四环素开关系统构建可诱导性表达-组织特异性基因敲除系统Cre重组酶的可控

lck启动子(胸腺细胞)、alphaA晶状体球蛋白启动子(眼晶状体)、钙调素依赖性激酶Ⅱ启动子(海马和大脑新皮质)、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)、、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)、aP2启动子(脂肪组织)、AQP2启动子(肾脏集合管)和肌浆蛋白启动子(骨骼肌)等。在何种组织细胞或器官中敲除某一特定的基因取决于所选择的启动子。启动子受某些外源性化学物质的调控，外源性调控的基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用。

只要选择合适的启动子调控Cre重组酶的表达，使其在生物体特定的部位、特定的条件下产生，就可以实现相应条件下某一特定基因的敲除。细胞类型特异的启动子lck启动子(胸腺细胞)、alphaA晶状体球蛋白启动子(Cre/LoxP重组系统基因敲除*目的基因在特定组织敲除目的基因在其他组织正常表达构建转基因小鼠产生双基因小鼠Cre/LoxP重组系统基因敲除*目的基因在特定组织敲除目的条件性基因敲除:在ES细胞上：——基因敲除(目的基因的替换及Neo基因敲除)——转基因(Cre基因的稳定转染)在载体构建上：——打靶载体(同源臂内侧是LoxP—目的基因—LoxP)——转基因载体(可诱导启动子下游是Cre基因)细胞特异性组织特异性条件性基因敲除:细胞特异性基因敲除小鼠工程2006年，美国NIH推出knockoutMouseProject(KOMP)将系统敲除或破坏小鼠的2万个基因计划投入5200万美元建立小鼠基因组突变基因数据库此计划将与加拿大NorthAmericanConditionalMouseMutagenesisProject(NorCOMM)及EuropeanConditionalMouseMutagenesisProgram(EUCOMM)合作，以避免重复工作基因敲除小鼠工程2006年，相关技术：基因敲除(geneknock-out)条件性基因敲除(conditionalgeneknock-out)TALENCRISPER/Cas9失活或抑制生物体内原有基因（DNA水平）Cas9isthenucleaseguidedbythecrRNAandtracrRNAtocleavespecificDNAsequences.(Deltchevaetal.2011)相关技术：失活或抑制生物体内原有基因（DNA水平）Cas9Summary:基因功能研究一般是在活细胞或生物体内、通过观察基因的终产物而实现的基本策略：在原有基因组的基础的增加外源基因(transgenictechnique)将基因组上原有的基因剔除(Genetargeting:knock-out,knock-in)封闭基因一级产物减少蛋白翻译的模板(RNAi,反义RNA)Summary:基因功能研究一般是在活细胞或生物体内、通过观小结第一节转基因技术第二节基因敲除技术小结第一节转基因技术【第一节转基因技术

重点内容】1、定义

*转基因技术（transgenictechnology）是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞（embryonicstemcell，即ES细胞），通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA。随后将受精卵或ES细胞植入假孕受体动物的子宫，使得转基因细胞发育成携带外源基因，并能稳定遗传的动物。转基因动物（transgenicanimal）指应用转基因技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物。转基因小鼠最为常见。**【第一节转基因技术重点内容】1、定义*转基因技术2、基本流程

*转基因载体的构建将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞。将转基因ES细胞移植胚泡中将转基因胚泡或转基因受精卵移植入假孕小鼠的子宫腔中鉴定并筛选转基因小鼠2、基本流程*转基因载体的构建【第二节基因敲除技术

重点内容】基因敲除(geneknock-out)属于基因打靶技术的一种，利用同源重组的原理，在ES细胞中定点破坏内源基因，然后利用ES细胞发育的全能性，获得带有预订基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯合个体。概念*【第二节基因敲除技术重点内容】基因敲除2.操作流程*将一条染色体上特定基因失活的ES细胞发育成特定基因缺失的杂合子小鼠。

构建基因敲除载体通过杂合子后代交配，获得纯合子基因敲除小鼠。

将基因敲除载体导入ES细胞：重组置换＊如何构建打靶载体？如何利用阳性和阴性筛选系统筛查重组的胚胎干细胞？2.操作流程*将一条染色体上特定基因失活的ES细胞发育3.条件性基因敲除*概念Cre/loxp重组系统基因敲除原理3.条件性基因敲除*概念5.反义RNA(anti-senseRNA)定义：与mRNA互补的RNA链，称作反义RNA。用途：封闭特定mRNA的翻译，从而使基因失活。实例：

BCL-2癌基因的anti-

senseoligonucleotide，通过与细胞内mRNA互补，封闭该基因的表达，从而治疗B淋巴瘤。5.反义RNA(anti-senseRNA)定义：与mR1995年，康奈尔大学Su博士的实验：用反义RNA(anti-senseRNA)转染线虫可以阻断par-1基因的表达；惊讶地发现：在正义RNA(senseRNA)的对照组中没出现预期的增强基因表达的现象，却出现了基因表达受抑现象。有趣的实验现象客观地呈现这一现象

Why？这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反，他们一直没能给这个意想不到的结果作出合理解释。1995年，康奈尔大学Su博士的实验：有趣的实验现象客观地呈1998年:

Fire和Mello的实验揭开这个悬疑之谜：AndrewZ.FireStanfordUniversitySchoolofMedicineCraigC.MelloUniversityofMassachusettsMedicalSchool用纯化后的单链RNA注射线虫，基因抑制现象是非常微弱的！将双链RNA给线虫注射，出现了高效、特异性的基因抑制效应。

解释：

SuGuo博士在转染正义RNA时污染了微量反义RNA，“十分错误”地将双链RNA(dsRNA)导入了细胞。双链RNA比单链RNA的基因抑制现象的要高效的多。1998年:Fire和Mello的实验揭开这个悬疑之谜将dsRNA去除后，再将正义的ssRNA

注入线虫卵中，没有产生基因沉默现象。将正义及反义ssRNA混合，经退火复性后得到的dsRNA注人线虫卵中可以显著地产生基因沉默现象，印证了Fire等提出的RNAi作用是由dsRNA引起的结论。1999年：Hunter等的实验进一步验证了RNAi的存在。将dsRNA去除后，再将正义的ssRNA注入线虫卵中他们将这种由双链RNA引起的特异性基因抑制现象，称作RNA干涉（RNAi）。Fire,A.etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature391,806-811.(1998)美国科学家安德鲁·法尔(左)和克雷格·梅洛(右)：发现了ＲＮＡ干扰机制。AndrewZ.FireStanfordUniversitySchoolofMedicineCraigC.MelloUniversityofMassachusettsMedicalSchool他们将这种由双链RNA引起的特异性基因抑制现象，称作RNA干（一）概念（二）发生机制（三）两种常用策略（四）存在的问题（五）应用6.RNA干涉(RNAinterference)（一）概念6.RNA干涉(RNAinterfer1.

RNAi技术的概念利用双链RNA

介导同源序列的mRNA特异性降解，导致的转录后基因沉默。1.RNAi技术的概念利用双链RNA介导同源序列的mR2.

RNAi技术的作用机制Dicer负责识别并切割dsRNARNaseⅢ家族中成员识别、降解双链RNA产生约21~23nt

bp片段每个片段3端有2个碱基突出2.RNAi技术的作用机制Dicer负责识别并切割dsRN橙色：解旋酶绿色：内切酶灰色：外切酶细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,

RISC)(由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）2.

RNAi技术的作用机制橙色：解旋酶细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体(RNA-

RISC中的解旋酶将其中的siRNA变成单链,成为activatedRISC。ActivatedRISC与靶mRNA互补结合，利用自身核酸内切酶活性将mRNA切断、降解。细胞内的异常dsRNA被Dicer酶特异识别、切割成长21~23nt的短双链RNA，称为小干扰性RNA(smallinterferingRNA,siRNA)。siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RISC)。RNA干扰的作用机制（2个阶段)**起始阶段效应阶段RISC中的解旋酶将其中的siRNA变成单链,成为ac确定目的基因，设计siRNA

序列A.化学合成或体外转录在体外获得

siRNAB.构建shRNA表达载体转染细胞转染细胞在细胞内产生SiRNARNAi效果检测3.RNAi技术的两种常用策略确定目的基因，设计siRNA序列A.化学合成或体外转录siRNA的化学合成

按照设计的序列分别合成两条反向互补的单链RNA

然后等比例混合退火即可。siRNA:5’-CGAUUGACAGCGGAUUGCCUU-3’3’-UUGCUAACUGUCGCCUAACGG-5’

SenseRNA:5’-CGAUUGACAGCGGAUUGCCUU-3’AntisenseRNA:5’-GGCAAUCCGCUGUCAAUCGUU-3’A.在体外获得siRNA途径siRNA的化学合成按照设计的序列分别合成两条反向互补的单SiRNAATargetingmRNAcleavagesuppressionSiRNASiRNA特点：将体外获得的siRNA转染到细胞内：通常在3-7天可以维持较高的基因表达抑制效应。大部分RNAi实验可以在此期间获得结果。优点：无需构建载体，节省时间。缺点：（1）效应期的长短主要取决于细胞的增殖速度，无法长期保存转染细胞！（2）转染效率无法保证！A.在体外获得siRNA途径SiRNAATargetingmRNAcleavageSiB.采用shRNA表达载体途径shRNA表达载体的表达框架包括：一个RNApolIII启动子，

一段发夹结构siRNA编码序列，一个RNApolIII终止位点。PromoterterminatorSensesequenceAnti-sensesequenceloopRNApolⅢ启动子(U6)可以在哺乳动物细胞中表达小分子RNA。B.采用shRNA表达载体途径shRNA表达载体shRNA构建shRNA表达载体UU3’5’LoopSensestrandAntisensestrand19nt将重组质粒转染细胞，在细胞内转录持续产生发夹shRNAB.采用shRNA表达载体途径shRNA构建shRNA表达载体UU3’5’LoopSens

shRNA

(shorthairpinRNA，短发夹RNA）策略：

利用shRNA表达质粒，质粒中含有编码正义和反义siRNA序列的DNA序列在细胞中转录出单链RNA，转录物随即形成发夹结构，中间有约9bp的不配对的序列，即为shRNA。shRNA被Dicer加工成siRNA，导致RNAi的发生。B.采用shRNA表达载体途径shRNA(shorthairpinRNA，通过转染shRNA表达载体，可以长期地抑制基因表达。在长效

RNAi实验（特别是体内试验）时，只能选择shRNA表达载体方法。优点：B.采用shRNA表达载体途径通过转染shRNA表达载体，可以长期地抑制基因表达。优点：B小结：RNAi实验的两种策略UUSiRNADicerRNaseIII(1)TransfectionA(2)(3)TargetingmRNAcleavagesuppressionSiRNA(4)SiRNAB小结：RNAi实验的两种策略UUSiRNADicerRN[Summary]

比较项目化学合成siRNA表达载体材料需求

21-merRNAoligos(一对)55-60-merDNAoligos(一对)制备的难易简单、快速需要制备重组载体该方法可在胞内持续产生siRNA，适用于长期研究;在体内试验时，只能选择该方法。将siRNA转染到细胞内：通常在3-7天可以维持较高的基因表达抑制效应。效应期的长短取决于细胞的增殖速度无法长期保存转染细胞转染效率无法保证！效应期的长短费用高中等可否进行标记可以不可以[Summary]

比较项目化学合成siRNA表达载体材料4.

RNAi技术存在的问题（1）

siRNA复合物除了预期的靶点，还能潜在地靶向多个基因。这个现象即“脱靶效应(off-targeting)

*”。问：你所设计的RNAi，会不会干涉其它基因的翻译？siRNA的Off-targeting的定义及其产生原因4.RNAi技术存在的问题（1）siRNA复合物除了预期问：RNAi为什么可能存在在脱靶(off-targeting)效应？正义链与RISC结合问：RNAi为什么可能存在在脱靶(off-targetin•解决办法：链偏好性（Strandbias）*使RISC只结合SiRNA的反义链。•解决办法：链偏好性（Strandbias）*RNAi技术还需进行不断的完善！siRNA并不能接近所有与其同源的mRNA分子，有些mRNA序列位于RNA的二级结构中，或与蛋白质形成紧密的复合物，碍阻了siRNA对靶序列的识别。因此，往往要经过不断的摸索才能选择出最佳的靶序列。目前虽然可将siRNA高效地导入体外培养的细胞。但，如何高效地、靶向性地导入动物体内特定组织，还是一个急需解决的问题！4.

RNAi技术存在的问题（2）RNAi技术还需进行不断的完善！siRNA并不能接近所有与（1）研究基因的功能5.RNAi技术的应用高效率易于操做可实现多种基因突变RNAi(knockdown)

VS

knockoutRNAi技术的优点：利用RNAi能在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点，可以很方便地研究基因的功能。（1）研究基因的功能5.RNAi技术的应用高效率RNA肿瘤细胞（2）基因治疗的新策略肿瘤治疗：由于单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi技术能同时特异性阻断多个癌基因的表达。如何设计实验？1.Dicer功能2.SiRNA的选择3.在体内研究功能肿瘤细胞（2）基因治疗的新策略肿瘤治疗：如何设计实验？Suppressionofheatshockprotein27induceslong-termdormancyinhumanbreastcancer

抑制HSP27,会诱导人乳腺癌长期休眠----ProcNatlAcadSciUSA.2012May29;基因功能研究的实例

SuppressionofheatshockprotHumanbreastcancercellline(MDA-MB-436)AngiogeniccellvariantNon-angiogeniccellvariantTheresearchersestablishedanexperimentalmodelforthestudyofhumantumorangiogenesisanddormancy.DevelopintobigTumorRemaindormantwithoutprogressionintodetectablediseaseHumanbreastcancercelllineHumanbreastcancercellline(MDA-MB-436)AngiogeniccellvariantNon-angiogeniccellvariantWesternblotanalysisResult1.Heatshockprotein27(HSP27)ishighlyup-regulatedinangiogenicbreastcancercells,comparedwithnonangiogeniccells.HumanbreastcancercelllineComparedwiththeoriginalcellline,expressionofHSP27proteinwas20%lowerinHSP27KD-1cells,70%lowerinHSP27KD-2cells,84%lowerinHSP27KD-3cells.AngiogenicbreastcancercellsweretransducedwithlentivirusesencodingthreedifferentshRNAsagainstHSP27(HSP27KD-1,HSP27KD-2,andHSP27KD-3).Result2.

AngiogenicbreastcancercellsHSP27-RNAiComparedwiththeoriginalcel具有促血管新生作用的人乳腺癌细胞接种到SCID小鼠HSP27基因被干涉的人乳腺癌细胞

（HSP27KD-3)接种到SCID小鼠TodeterminetheeffectofHSP27suppressionontumorgrowth,SCIDmicewereinoculatedwithcontrolorHSP27KD-3cells.具有促血管新生作用的人乳腺癌细胞接种到SCID小鼠HSP27RESULT3.Up-RegulationofHSP27inNonangiogenicHumanBreastCancerCellsInducesExpansiveTumorGrowthinVivo.Nonangiogeniccells(controll)withintrinsicallylowHSP27NonangiogeniccellstrancfectedwithHSP27-GFP,couldexpresshighlevelofHSP27TransferintoSCIDmiceTransferintoSCIDmice?WhyisHSP27responsibleforpromotingtumorprogression?RESULT3.Up-RegulationofHSResult4.Down-regulationofHSP27leadstoReducedsecretionofVEGF-A,VEGF-C,andbasicfibroblastgrowthfactor.Bluebarmeans

HSP27gene-silencedangiogeniccellsbythethirdSiRNA,inwhich

expressionofVEGF-A,VEGF-C,andbFGFwassignificantlyreducedRedbarmeans

angiogeniccellscontrol,whichcouldsecret

VEGF-A,VEGF-C,andbFGFTheyanalyzedthesecretionofimportantangiogenicfactorsbyELISAinHSP27gene-silencedangiogeniccells.HSP27promotestumorgrowth

byup-regulatingthesecretionofangiogenesis-relatedgrowthfactors

Result4.Down-regulationof基因功能分析总结基本思路：一、将外源基因导入受体细胞或生物体内——获得新基因——获得额外拷贝的基因二、失活或抑制细胞或生物体内原有基因——在DNA水平——在mRNA水平基因功能分析总结基本思路：一、将外源基因导入受体细胞或生物体内相关技术：基因转染

(genetransfection)——细胞水平转基因转基因技术(transgenictechnique)（1）转基因小鼠、转基因羊（2）转基因植物一、将外源基因导入受体细胞或生物体内相关技术：（1）转基因小在DNA水平上：基因敲除(geneknock-out)条件性基因敲除(conditionalgeneknock-out)TALENCRISPER/Cas9二、失活或抑制生物体内原有基因（DNA水平）在RNA水平上：反义RNA

(anti-senseRNA)RNA干涉(RNAinterference)在DNA水平上：二、失活或抑制生物体内原有基因（DNA水平）该基因表达时，呈现某种功能；该基因被敲除时，该功能消失或下降；该基因恢复时，该功能得到恢复。基因功能分析基因功能研究一般是在活细胞或生物体内、通过观察基因的终产物而实现的：该基因表达时，呈现某种功能；基因功能分析基因功能研究一般是在Thanks！Thanks！平时作业（10分）：背景：有一些乳腺癌组织和癌旁组织标本已知乳腺癌相关基因包括Her2、BRCA1/2和p53等题目：请以任一乳腺癌相关基因为研究切入点，从基因结构分析、基因表达和基因功能三个层面制定一套研究策略注：1)只提出利用什么方法可以达到什么目的即可，不用说明实施的具体方法和流程2)最后一次实验课交平时作业提示：Her2是癌基因，过度活化或过度表达可引起细胞过度增生BRCA1/2和p53都是抑癌基因，表达减少或突变可致细胞过度增生平时作业（10分）：背景：题目：提示：ThankYouforyourattention!ThankYouforyourattention!基因的生物学功能鉴定技术

复旦大学复旦大学复旦大学基因的生物学功能鉴定技术复旦大学复旦大学复旦大学第一节转基因技术第二节基因敲除技术第三节RNA干涉基因功能的鉴定技术第一节转基因技术基因功能的鉴定技术基因敲除(geneknock-out)基因敲除(geneknock-out)属于基因打靶技术的一种，利用同源重组的原理，在ES细胞中定点破坏内源基因，然后利用ES细胞发育的全能性，获得带有预订基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯合个体。概念*（*为教学重点）基因敲除(geneknock-out)基因敲美国犹他大学Eccles

人类遗传学研究所

马里奥·卡佩奇Mario

R.

Capecchi英国卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院马丁·埃文斯Martin

J.

Evans美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院奥利弗·史密斯Oliver

Smithies基因敲除技术发展及成果1989年成功对一只老鼠进行基因打靶

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2007MarioR.CapecchiSirMartinJ.EvansOliverSmithies美国犹他大学Eccles

人类遗传学研究所

马里奥2.基本原理利用DNA同源重组的原理，在活体内将特定基因从染色体上剔除的过程。GenomicDNA:TargetingDNAfragment:GenomicDNA/geneknockedout:LostitsoriginalfunctionHomologousarmsequence2.基本原理利用DNA同源重组的原理，在活体内将特定基因从3.操作流程*

将基因敲除载体导入ES细胞：重组置换＊用选择培养基筛选已击中的细胞﹔将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物（缺失的杂合子小鼠）。

构建基因敲除载体通过杂合子后代交配，获得纯合子基因敲除小鼠；对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。3.操作流程*将基因敲除载体导入ES细胞：重组置换＊用构建基因敲除载体基因敲除载体的特点：待敲除基因的同源臂序列阳性筛选标记基因（NeoR)阴性筛选标记基因

(TK

gene)PTargetingvector打靶载体问题：如何构建打靶载体？PositivescreeningmarkergeneHomologousarmsHSV-TkgeneNeoRestrictionenzyme打靶载体PTargetingvector

LinearizethetargetingvectorHomologousarmsofgenewaitingforbeingknockedoutNegativescreeningmarkergene:TKgeneNeoR*HSV-TK构建基因敲除载体基因敲除载体的特点：待敲除基因的同源臂序列P>基因敲除载体的构建过程：待敲除基因PCloningvectorPRecombinantcloningvectorPRecombinantcloningvectorNeoRgenePRecombinantcloningvectorPRecombinantcloningvectorTkgenePTargetingvector将待敲除基因切除大部分使其失活，留下用于重组的同源臂同源序列中间插入了NeoR基因构建打靶载体在同源臂的外侧线性化载体>基因敲除载体的构建过程：待敲除基因PCloningvecEScellPTargetingvectorRestrictionenzymeHomologousarmsHSV-TkNeo如何筛选出同源重组的ES细胞呢？2.将基因敲除载体导入ES细胞：重组置换＊小鼠受精卵发育第3～5天（分裂至8个细胞左右）时的胚泡细胞；能在体外培养，具有发育的全能性。EScellPTargetingvectorRestriES细胞中同源重组的示意图同源重组在哺乳动物细胞中发生的概率（10-5），一个合适的筛选方法对于减小工作量是十分必要的。如何筛选出同源重组的ES细胞呢？ES细胞中同源重组的示意图同源重组在哺乳动物细胞中发生的概率PTargetingvector打靶载体NeoR阳性筛选标记基因（NeoR)抗新霉素抗药基因。G418是一种和新霉素结构相似的抗生素。G418可以筛选所有能表达neo基因的细胞。阴性筛选标记基因

(TK

gene)HSV-TK基因的表达产物是胸苷激酶，此酶能分解单核苷酸类似物，并且分解产物是有毒性的。普通细胞因无TK基因

，可在含单核苷酸类似物的培养基中生长。如果Tk基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡HSV-TK正负筛选系统筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？PTargetingvector打靶载体NeoR阳性筛选标1.同源重组HSV-TkNeo

EScellsP53gene正负筛选系统工作原理P53gene10-5-10-6NeogeneNeor基因进入ES细胞的基因组P53基因被替换在G418、单核苷酸类似物的培养基中，可以存活。2.随机插入，非同源重组P53geneNeogeneHSV-TkP53geneNeor基因和HSV-TK基因同时进入ES细胞的基因组在G418培养基中存活，但是含有单核苷酸类似物培养基中死亡。P53基因没有被替换1.同源重组HSV-TkNeoEScellsPPositive-negativeselectionHomologousrecombinantsG418

Neomycin(positiveselection)killsthenon-insertions;Gancyclovir(negativeselection)killstherandominsertionsInsurvivalcells,P53geneisreplacedbyNeo.MediumwithG418&GancyclovirNormalEScellsTransfectionPositive-negativeselectionHom3.利用ES细胞发育的全能性，将一条染色体上特定基因失活的ES细胞发育成特定基因敲除的小鼠。???A.基因敲除ES细胞注射入胚泡B.嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中C.嵌合体小鼠的繁育，获得杂合子小鼠D.杂合子小鼠交配，获得基因敲除的纯合子小鼠3.利用ES细胞发育的全能性，将一条染色体上特定基因失活3A.基因敲除的ES细胞被注射入胚泡。Mate3days.ProvidestheblastocystwithnormalEScell

InjectChimericBlastocystoriginalinnercellmassNormalMouseembryo嵌合胚泡3A.基因敲除的ES细胞被注射入胚泡。Mate3days3B.嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中嵌合体小鼠一些器官有些细胞来自于囊胚，有些来自于ES,就会产生嵌合现象。皮肤细胞：囊胚（黄色），ES（黑色）黑细胞和黄细胞之间的基因组在任何单个细胞内并没有交集嵌合体小鼠带着两套完全不同的基因组。3B.嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中嵌合体小鼠一些器官有些细胞来3C.嵌合体小鼠的繁育，获得杂合子小鼠♀♂Mate正常小鼠嵌合体小鼠杂合子小鼠杂合子小鼠：一条染色体P53基因突变；另一条染色上基因是野生型的。正常小鼠1／2Heterozygousmice如果嵌合体小鼠的生殖细胞是由基因敲除的ES细胞发育成的。所有细胞都是3C.嵌合体小鼠的繁育，获得杂合子小鼠♀♂Mate正常小3D.杂合子小鼠交配，获得基因敲除的纯合子小鼠♂♀Mate1／4纯合子基因敲除小鼠3D.杂合子小鼠交配，获得基因敲除的纯合子小鼠♂♀Mat小结：基因敲除的操作流程

*嵌合体杂合子小鼠基因敲除的纯合子小鼠与阴性小鼠交配123A3B3C3D小结：基因敲除的操作流程*嵌合体杂合子小鼠基因敲除的纯合上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活，但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR),该基因会影响机体正常的功能。怎么改进？扩展知识：有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体,

针对这类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活，条件性基因敲除*将某个基因修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。

条件性基因敲除*将某个基因修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或条件性基因敲除Cre/loxp系统利用可诱导性启动子和Cre重组酶特异性识别位点构建基因敲除载体，通过诱导剂实现可控性基因敲除。两个要素：Cre重组酶诱导型启动子条件性基因敲除利用可诱导性启动子和Cre重组酶特异性识别位点一种343个氨基酸组成的单体蛋白质，属于位点特异性重组酶。从噬菌体P1提取获得。特异性识别loxp序列，可以引发loxP位点的DNA重组。一段长34bp的DNA序列，含有两个13bp的反向重复序列和一个8bp的核心序列。这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点。Cre重组酶和loxp序列13bp13bp8bp这8bp的序列决定Loxp位点的方向Cre结合位点Cre结合位点

核心序列一种343个氨基酸组成的单体蛋白质，属于位点特异性重组酶。CCre重组酶介导的重组方式1.回顾一下同源序列同源重组Cre重组酶介导的重组方式1.回顾一下同源序列同源重组Loxp是一段34bp长的回文序列，在两段反向重复的13bp片段之间有8bp的间隔序列，这8bp的序列决定Loxp位点的方向。TATTGAAGCATAT

CGTATGTA

ATATGCTTCAATAATAACTTCGTATA

GCATACAT

TATACGAAGTTATTATTGAAGCATAT

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ATATGCTTCAATAATAACTTGCTATA

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TATACGAAGTTATTATTGAAGCATAT

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ATATGCTTCAATAATAACTTGCTATA

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TATACGAAGTTAT同源重组Cre重组酶介导的重组方式Loxp是一段34bp长的回文序列，在两段反向重复的13bpCre重组酶和loxp序列Cre重组酶和loxp序列Cre/LoxP重组系统：---特定阶段敲除基本策略：使待敲除基因位于两个LoxP位点之间。loxP位点被引入到相应基因的内含子内，胚胎发育期间不会影响相应基因的功能。特定阶段：Cre酶切割靶基因。Cre/LoxP重组系统：---特定阶段敲除基本策略：Cre/LoxP重组系统基因敲除的原理*基本策略：使待敲除基因位于两个LoxP位点之间Cre重组酶的可控性表达Cre/LoxP重组系统基因敲除的原理*基本策略：采用胚胎干细胞技术获得转基因小鼠（1）转基因表达载体的构建在体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位点的基因敲除载体（2）将体外构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞

基因敲除载体通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列。（3）将转基因ES细胞或受精卵细胞移植胚泡中，将转基因胚泡移植入假孕小鼠的子宫腔中（4）鉴定并筛选转基因小鼠1.如何构建靶基因被两个LoxP位点锚定的转基因小鼠采用胚胎干细胞技术获得转基因小鼠1.如何构建靶基因被两个Lo（1）条件性基因敲除载体的构建基因敲除载体的结构是：4NeoLoxPLoxPLoxPTK如果基因组序列是：1234待敲除基因1.如何构建靶基因被两个LoxP位点锚定的转基因小鼠（1）条件性基因敲除载体的构建基因敲除载体的结构是：4Neo基本流程：条件性基因敲除载体的构建在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除12344NeoLoxPLoxPLoxPTK1234NeoLoxPLoxPLoxPHomologousrecombinationGenomicDNA:使待敲除基因位于两个LoxP位点之间基本流程：12344NeoLoxPLoxPLoxPTK123使待敲除基因位于两个LoxP位点之间基本流程：条件性基因敲除载体的构建在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除在ES细胞中敲除Neo基因1234NeoLoxPLoxPLoxPCreexpressiongenewastransientlyintroducedintotargetedEScellsCre1234LoxPLoxP左右Loxp突变体(Lox71/Lox66)使待敲除基因位于两个LoxP位点之间基本流程：1234Neo靶基因被两个LoxP位点锚定的转基因小鼠靶基因被两个LoxP位点锚定的转基因小鼠,称为loxp

floxed小鼠。“loxPfloxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，“loxp”小鼠表型仍同野生型的一样。靶基因的修饰(切除)是以Cre的表达为前提的。只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。靶基因被两个LoxP位点锚定的转基因小鼠靶基因被两个LoxP2.如何构建Cre重组酶的转基因小鼠Cre重组酶的可控性表达第二只小鼠采用胚胎干细胞技术获得。在这只小鼠中，Cre重组酶被置于某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定的条件下表达。在这种小鼠的体内，Cre重组酶可在特定组织内进行可控性表达。2.如何构建Cre重组酶的转基因小鼠Cre重组酶的可控性表达Cre重组酶的可控性表达使Cre基因位于可诱导性启动子下游：TRECreinducerON红色的半圆圈为：四环素阻遏蛋白（TetR）圆圈：_诱导剂：四环素当四环素存在时，TetR构象发生改变，基因表达Cre重组酶的可控性表达使Cre基因位于可诱导性启动子下游Cre重组酶的可控性表达构建可诱导性表达-组织特异性基因敲除系统使Cre基因位于可诱导性启动子下游：TRECreCreinducerONCreCreCre1234LoxPLoxPCreCreCreCre123LoxP利用控制Cre表达的启动子的活性，通过对诱导剂给予时间的控制。从而在1oxP动物的一定发育阶段实现对特定基因进行遗传修饰。Cre重组酶的可控性表达构建可诱导性表达-组织特异性基因敲除构建可诱导性表达-组织特异性基因敲除系统Cre重组酶的可控性表达rtetRTissue-specificpromoterrtetRtetTRECreON1234LoxPLoxPCreCreCreCreTeT阻遏蛋白四环素开关系统构建可诱导性表达-组织特异性基因敲除系统Cre重组酶的可控

lck启动子(胸腺细胞)、alphaA晶状体球蛋白启动子(眼晶状体)、钙调素依赖性激酶Ⅱ启动子(海马和大脑新皮质)、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)、、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)、aP2启动子(脂肪组织)、AQP2启动子(肾脏集合管)和肌浆蛋白启动子(骨骼肌)等。在何种组织细胞或器官中敲除某一特定的基因取决于所选择的启动子。启动子受某些外源性化学物质的调控，外源性调控的基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用。

只要选择合适的启动子调控Cre重组酶的表达，使其在生物体特定的部位、特定的条件下产生，就可以实现相应条件下某一特定基因的敲除。细胞类型特异的启动子lck启动子(胸腺细胞)、alphaA晶状体球蛋白启动子(Cre/LoxP重组系统基因敲除*目的基因在特定组织敲除目的基因在其他组织正常表达构建转基因小鼠产生双基因小鼠Cre/LoxP重组系统基因敲除*目的基因在特定组织敲除目的条件性基因敲除:在ES细胞上：——基因敲除(目的基因的替换及Neo基因敲除)——转基因(Cre基因的稳定转染)在载体构建上：——打靶载体(同源臂内侧是LoxP—目的基因—LoxP)——转基因载体(可诱导启动子下游是Cre基因)细胞特异性组织特异性条件性基因敲除:细胞特异性基因敲除小鼠工程2006年，美国NIH推出knockoutMouseProject(KOMP)将系统敲除或破坏小鼠的2万个基因计划投入5200万美元建立小鼠基因组突变基因数据库此计划将与加拿大NorthAmericanConditionalMouseMutagenesisProject(NorCOMM)及EuropeanConditionalMouseMutagenesisProgram(EUCOMM)合作，以避免重复工作基因敲除小鼠工程2006年，相关技术：基因敲除(geneknock-out)条件性基因敲除(conditionalgeneknock-out)TALENCRISPER/Cas9失活或抑制生物体内原有基因（DNA水平）Cas9isthenucleaseguidedbythecrRNAandtracrRNAtocleavespecificDNAsequences.(Deltchevaetal.2011)相关技术：失活或抑制生物体内原有基因（DNA水平）Cas9Summary:基因功能研究一般是在活细胞或生物体内、通过观察基因的终产物而实现的基本策略：在原有基因组的基础的增加外源基因(transgenictechnique)将基因