大肠杆菌R基因克隆载体地构建与鉴定

实用标准文案[摘

大肠杆菌基因克隆载体的构建与鉴定要DNA的重组与转化是分子生物学的基本实验操作。本实验可分为质粒DNA提取与鉴定，目的片段扩增与鉴定，DNA组与转化三部分。本次实验可以全面提高学生的实验技能与逻辑思维，对于分子实验技能的培养具有重要意义。[关键词DNA重组；转化；分子实验基本操作大肠埃希氏菌是常用的实验菌种其质粒为人工设计已加入R目的基因片段。现需要将R基因转到pMD18-TSimple载体质粒上，并将目标质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，并检验转化效率。1

材料与法1.1材1.1.1

料菌株及质粒E.coliDH5α；R-pGEX-4T-1质粒；pMD18-T载体。1.1.2主要试剂和仪器

溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，TE缓冲液，EDTA，5*TBE氯仿异戊（V:V24:1乙醇50mg/mLCarb10*loading-buffer，2.5mmol/LdNTP合物，Taq酶，DNA模板，引物对，buffer，50*TAE，0.1MCaCl液，LB固体/液体培养基，5，34mg/mlCam，3MNaAC，210mg/mLX-，mg/mL（以上常规试剂全部按照《分子生物学实验指导》要求配制恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅，凝胶成像仪，琼脂糖凝胶电泳系统，PCR热循环仪，低温离心机，超净工作台。1.2方1.2.1

法质粒DNA提取

向含Carb100μg/mL）的LB液体培养基中接入含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。质粒用碱裂解法制备，具体步骤参照《分子生物学实验指南用1％琼脂糖凝胶电泳验证质粒提取结果。1.2.2质粒酶切及鉴定运用Ⅰ酶与Ⅰ酶对上述步骤中提取的质粒R-pGEX-4T-1进行双酶切，酶切反应体系参见表（如下37℃反应1.5小时。并用1％琼脂糖凝胶电泳验证酶切结果。1.2.3目的DNA片段的扩增与纯化

根据质粒R-pGEX-4T-1的序列，设计一对R基因引物（表2）用于R基因的扩增。PCR应体系以质粒DNA为模板，用25精彩文档

实用标准文案μL反应体系进行扩（表3应条件94℃预变性5min94℃变性40sec，55℃退火50sec，72℃延伸50sec，重复30个循环，72℃延伸8minPCR产物经琼脂凝胶电泳图像分析鉴定,并按照胶回收试剂盒步骤胶纯化收PCR产物，-20℃低温保存。表1

酶切反体系

表3PCR应体系EcoRⅠXho10×H质粒无菌水总体积

1L1L2L8L≤1μg8L20μL（无菌水补至总体积）

表2

反应物10×PCR缓液25mmol/LMgCl22.5mmol/LdNTP引物1引物2

体积（μL）2.51.521.51.5扩增因所用物

TaqDNA聚合酶模板DμL)

0.22引物12

引物序列5’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’5’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’

扩增长度600bp

加d至L

13.81.2.4DNA重组与转化

用CaCl理大肠杆菌，制备感受态细胞，具体步骤参2照《分子生物学实验指南按照4构建连接重组体系，16℃连接反应30min，制备重组质粒。将5μL连接产物加入至200Lα感受态细胞中，冰中放置30min；热激，恢复性培养后去上清涂布于含有、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基，倒置平皿37培养过夜（1216h形成单菌落，计数白色、蓝色菌落。表4

质粒连重组体系pMD18-TSimpleVector（50ng/μ）InsertDNA（0.1pmol～0.3pmol）

0.5μL3μLLigationMix总体积

ddH2Oupto5μL5μL10μL2结果2.1质粒DNA提取结果鉴定2.1.1质粒提取后，1％琼脂糖凝胶电泳实验结果图缺失）精彩文档

实用标准文案2.1.2质粒双酶切二次鉴定1％琼脂糖凝胶电（如图一）显示出特异性条带说明质粒中确含有R基因，质粒提取成功。M：maker；：双酶切结果产物M：DL2000maker；：R基因产物图一质粒R-pGEX-4T-1双酶切鉴定结果

图2R基因PCR鉴定结果2.2目的DNA片段的扩增鉴定

用所设计的引物对目的片段R基因进行克隆，得到R基因（600bp如图二）条带清晰、亮度高，证明PCR结果较为理想。2.3DNA转化结果鉴定长出。3讨论

本部分实验结果不成功，培养基表面涂花，无单菌落细菌质粒的获取，与DNA重组与转化是分子生物学的基本实验操作。在本次实验中。成功实现了质粒DNA的提取与鉴定目的基因的克隆与鉴定，细菌感受态细胞制备与质粒DNA重组与转化。在实验中，也有操作不理想之处分析转化鉴定没有结果的原因，有以下几点Amp可能加入过早，未待平板冷却，导致加入的失活，故没有Amp抗性的培养基上长满了菌，而不出现白色的单菌落eq\o\ac(○,2)烧热的涂棒未冷却便进行菌液涂布，导致培养基表面融化eq\o\ac(○,3)菌液未充分混匀，平