基因编辑技术课件

分子遗传学研究新技术基因编辑技术生物化学与分子生物学·基因编辑是一项旨在对基因组进行定点修饰的新技术，目前主要有人工核酸酶介导的锌指核酸酶（ZFN）技术、转录激活子样效应物核酸酶（TALEN）技术和RNA引导的CRISPR/Cas核酸酶（CRISPR/CasRGNs）技术它们都能特异性地识别靶位点对其单链或双链进行精准切割后由细胞内源性的修复机制来完成对靶标基因的敲除和替换。CRISPR/Cas系统的发现CRISPR/Cas系统作用机制一、在噬菌体入侵的起始阶段,Cas蛋白复合物靶向并裂解噬菌体基因组中的原型间隔序列(protospacer),原型间隔序列接下来整合到宿主基因组的CRISPR位点的5′端；二、掺入的protospacer被转录成crRNA;三、在Cas蛋白复合物的参与下,靶向和干扰侵入的噬菌体DNA序列。

三个阶段在CRISPR位点附近,存在一系列CRISPR相关(CRISPR-associated,Cas)基因，是一个较大的多态性家族,编码的蛋白具有核酸相关的功能域。CRISPR/Cas免疫系统被分为三种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链,而Ⅱ型CRISPR/Cas免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链,目前Ⅱ型系统是被改造的最为成功的人工核酸酶。体外实验证明Cas9基因是参与CRISPR免疫系统的唯一必需基因。Cas家族图a基于Ⅱ型CRISPR/Cas系统,科研工作者发明了一种便捷的基因组编辑技术,该技术已经成功应用于大肠杆菌、肺炎双球菌、酿酒酵母、斑马鱼、小鼠细胞、小鼠、人类多种细胞系、果蝇、线虫、大鼠、水稻、小麦、拟南芥等（如表1）。TALEN介导的基因组定点修饰技术

TALE蛋白家族来自一类特殊的植物病原体——黄单胞杆菌(Xanthomonas

spp.)。

TALE蛋白类似于真核生物的转录因子,

它可以通过识别特异的DNA序列调控宿主植物内源基因的表达,

从而提高宿主对该病原体的易感性。把TALE中的转录激活结构域(AD)替换成核酸内切酶的切割结构域,

构建成TALE核酸酶（即TALEN）,

对基因组的特定靶位点进行定向切割,

从而实现基因打靶。TALEN的结构DNA结合结构域的重要部分靶向识别碱基的关键氨基位点

FokⅠ通常需要以二聚体的形式发挥其切割DNA序列的功能,

因此,TALEN

通常是成对使用。TALE蛋白的中部包含一段很长的、串联排列的重复序列,

这种重复序列为这一蛋白家族所独有,

是其DNA结合结构域的一个重要组成部分,

具有特异性识别并结合特异DNA序列的特性。因此构建识别特定DNA序列的TALE（如表2）就成为这一技术中的一个关键步骤和TALE应用中的主要瓶颈。表2TALEN的构建通过用户定制的TALEN随意改造复杂的基因组,

依然是TALE应用中最为吸引人的。毋庸置疑,

TALEN技术对基础研究、生物技术和人类基因治疗等诸多领域都会产生重大影响,

堪称基因组定点修饰技术的一场革命。它开辟了前所未有的方式来剖析任意物种的基因功能,

还可以在同一个细胞系上利用TALEN技术产生不同的遗传病模型,

为人类遗传病或后天的基因紊乱疾病开启了新的治疗途径。TALENs在基因组定点修饰方面具有广泛的研究和应用，然而,ZFNs和TALENs这两项技术在实施操作过程中技术难度较大、构建组装时间较长,一般实验室很难得到有效利用。CRISPR/Cas操作简单,制作成本低,适用于普通分子生物学实验室。与之前的基因定点改造技术ZFNs及TALENs相比,CRISPR/Cas系统具有显著优点：可以对任何后面紧随NGG(PAM)的20bp的序列进行编辑;能同时作用于多个靶位点;此外,载体构建简单,Cas9基因是相同的,针对特定基因位点只需要设计sgRNA,而ZFNs或TALENs对每个基因位点编辑都需要设计和组装两个核酸酶,所以CRISPR/Cas系统更容易在实验室中得到推广和应用。然而