TK1检测项目指导手册

....第一局部工程运行意义概述胸苷激酶1简称TK1，是一种国际公认的细胞增殖特异性标志物；它参与DNA补救合成途径,是DNA合成的特别标志酶。临床上,可用于监测和评估体内细胞的特别增殖速度。〔非增殖细胞TK1酶含量极微，而随着增殖类疾病的发生，尤其是肿瘤、组织特别增生类疾病，细胞发生过度增殖，血清中TK1酶的含量消灭显著上升，超过安康人平均水平2倍甚至100倍以上。所以，通过检测血清中TK1浓度水平的变化，能够敏感地觉察细胞增殖特别，动态评估细胞增殖进展趋势，为提前干预治疗高风险癌前病变，遏制肿瘤进程供给重要信息。在瑞典卡罗琳斯卡大学(诺贝尔医学和生理学奖评审机构)二十多年的研发根底上,华瑞同康生物技术〔深圳〕与瑞典Karolinska大学TK1争论团队共同研制出高灵敏度的胸苷激酶1〔TK1〕细胞周期分析试剂盒及CIS系列化学发光数字成像仪，该系统是世界上唯一用于临床检验血清中TK1浓度的产品，其特异性高于95%,对各类增殖性疾病的综合检测70%。该系统已在多临床领域得到较为广泛地应用：1、独立的肿瘤预后因子：多国家，多机构的争论说明，TK1是优选的预后评估指标，可作为独立的肿瘤预后因子；2、动态评估手术、放化疗效果：能够对各种实体肿瘤〔例如：肺癌，胃癌，结肠癌，直肠癌，食道癌，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌等〕以及白血病和淋巴癌患者的治疗效果进展评估，为治疗方案的改善供给参考；3、更早评估肿瘤复发风险：对肿瘤康复期患者进展动态跟踪，较影像学更早提示肿瘤复发或转移风险信号；4、评估各类增殖类疾病恶变风险：处于过度增殖的增殖类疾病是肿瘤形成的第一步。基于TK1与细胞增殖的亲热关系，能够灵敏地通过TK1的浓度变化，觉察恶性增殖风险，为肿瘤的癌前干预供给了更有效率，更有价值的信息，适用于无疾病人群的恶性增殖风险筛查。其次局部工程运行预备一.工程环境1、环境参数温度：24-25℃；湿度：小于65%；试验用水：双蒸水；去离子水；2、试验室设置要求：8-91.5m×0.8m3m×1m控温设备：302进展控温,或选用恒温摇床，如以以以以下图：二、工程所需设备1、试验用设备2脱色/恒温摇床20-100r/min1免疫孵育〔平摇〕3台式离心机0-4000r/min1分别血清4冰箱2-8℃冷冻-20℃1保存试剂保存样本5打印机USB1输出检测结果6恒温水浴锅单孔或双孔1把握反响液温度编号1编号1设备名称化学发光数字成像规格要求数量CIS1用途采集发光信号和分析数据〔1〕试验用工具：编号工具名称规格要求数量用途1移液器0-10μl1血清点样2移液器20-100μl1配制反响液3移液器100-1000μl1分装和检测样本4试剂瓶500ml2配制工作液6烧杯100ml2配制工作液7电子计时器无1试验提示8探头温度计-50℃-50℃1把握试验温度9塑料镊子平头1试验需要10反响盒24T、48T、96T1适用于对应规格的产品使用11量筒25ml1配制工作液12量筒250ml1配制工作液〔3〕试验耗材编号耗材名称规格要求用量用途1移液器枪头20μl样本配套0-10μl2移液器枪头200μl2/配套20-100μl次次3移液器枪头4分装管5吸水纸1ml500μl1ml无次样本-65.5-9.0-用使用血清分装时使用染测定缓冲液PH三、试验样本处理要求及保存样本种类：血清采集要求：1必需使用无任何添加剂的真空采血管；2、取静脉血2m〔室温；34、脂血、溶血样本可能造成试验结果的偏差，不建议使用；样本处理：137℃水浴至凝固后离心使用；24000r/min，离心时间：5min；3h；样本保存：1100-200μl/管，放置于-20℃保存；2、-2073、如需长时间保存，建议提高分装量〔1.5m，并放置于-80℃〔可保存3年左右样本运输：1、样本如需外送检验〔本市范围内或行程小于3小时，建议采血后先放置于2-8℃静置，到检验点后取出离心，处理要求同上；2、样本如需外送检验〔外省市，建议离心后分装至分装管中，血清分装量1.5ml/管，运输介质建议使用保温箱+化学冰+干冰，干冰用量2/24小时〔依据路程消耗时间增量；样本复融：123反复冻融的血清样本严禁使用。第三局部工程核心产品简介一、胸苷激酶1细胞周期分析试剂盒注册号：粤食药监械〔准〕字2023第2400369号规 格：24人份、48人份、96人份储存条件：2-8℃有效期：6〔具体日期见试剂盒标签〕使用要求：开封后一次性使用单次试验用时5-6h〔依据样本数量有所差异工作通量：300-400/天1主要组成成份：试剂盒由校准品、抗TK1-IgY、生物素化抗IgY二抗、SA-HRP、ECL1、ECL2、浓缩稀释液、浓缩洗涤液、封闭剂、硝酸纤维素膜主要成分组成。组分名称、装量详见产品说明书，并以产品说明书为主。二、CIS系列化学发光数字成像注册号：粤食药监械〔准〕202324008791、设备性能参数●系统偏差：±5%12bit(1)●区分率：1392〔H〕×1040〔L〕1%●拍摄范围：12cm×9cm●工作环境温度：10-30℃●单次批处理力气：96/次●读出噪音：≤7e-rms@20MHz●降噪力气：专业级高效半导体制冷CCD，集成噪音软处理功能2、主要构造部件CIS-2化学发光数字成像、免疫点印迹分析软件、加密狗、Lenovo2第四局部工程试验操作一、工程原理概述1、TK1先将含有TK1抗原血清吸附在硝酸纤维素膜固相载体上，用抗人TK1-IgY抗体识别抗原〔，生物素化抗IgY二抗识别抗原-抗人TK1-IgY〔B素连接〔C，在参与发光底物后，亲和素化辣根过氧化物酶催化底D，必需通过CCD的信号采集设备进展采集和分析〔3〕32、试验结果分析：将反响完毕的样本载体，放入暗室〔避开外界光的干扰〕，通过周密的制冷CCD存后得到样本发光图片，通过校准品固定浓度与亮度的关系，绘制标准曲线，进而计算出其他样本TK1二、试验操作流程1、试验预备局部：血清预备：请参照《试验样本处理要求及保存》章节；试剂工作的最正确温度为25-26证明验工作液温度到达该标准；试验前需认真清洗玻璃器皿：洗涤液清洗→清水冲洗→试验用水润洗检测试验用设备和工具是否都处于正常工作状态〔包括化学发光数字成像，对于觉察的特别状况进展准时排解；依据说明书要求配制试验所需的稀释液和洗涤液，保证配制好pH7.2-7.8；2、试验操作把握1上样量为3μl；a.取样后，枪头贴壁2-3次；b.加样枪垂直；c.扶稳加样枪，枪头固定于孔中心；d.保证样本打出后直接被膜吸附；2温度28-30℃，65%的环境进展晾干，30min；3待膜晾干完毕，将膜放入反响盒，倒入双蒸水或去离子水，使膜浸60-70r/min21min;4封闭剂使用稀释液配制3g+50ml稀释液；使用磁力搅拌器混匀5mi〔或用手快速搅匀10-15mi35-45r/min的转速摇动，30min；5TK1-IgY将封闭液摇匀〔盒底无沉淀〕后倒出，然后加一抗反响液〔一抗稀释浓度见试剂盒内说明书40μl封闭剂/10ml反响液的比例添加封闭剂；以35-45r/min；反响2h；反响液温度把握在25℃左右；6倒去一抗反响液，先用洗涤液快速漂洗两次，再倒入洗涤液以60-70r/min35min；7IgY按说明书稀释倍数进展稀释，35-45r/min40min；反响液温25℃左右；869SA-HRP：按说明书稀释倍数进展稀释，35-45r/min反响60min；反响液温25℃左右，10、洗涤同611、ECL取出洗涤好的膜，在吸水纸上控干后放在发光盒中，将ECL1、2混合后均匀倒在膜上，1min马上开头倒计时5min，将膜夹入压膜片中，用滚筒压平，放入化学发光仪中调整位置〔十字穿插中心5min三、试验结果分析1、工作前预备：连接好电源，启动设备〔可在拍摄前5min启动；运行免疫点印迹分析软件；在登录界面输入用户、密码后，进入软件操作页面〔特别状况。2、试验结果猎取流程预拍将试验膜片放入化学发光仪中调整位置〔十字穿插中心“读取CCD或者点击快捷按钮——单击“预拍。试验图像的猎取：读取图像”的提示〔特别状况2，取读取背景图像应用试验图像的处理点击“应用范围，生成结果图像，点击“关闭CCD试验图像的保存点击图像—另存待分析图像pwk，或快捷按，选择保存位置保存待分析图像后关闭图像，所保存的文件后缀名为pwk试验时间+试剂批号，例如：20231212-NT1131101A43、图像分析操作方法建试验和工作图像的猎取点击“试验”——建试验，或快捷按钮 ，翻开建试验对话框，填写试验名称、报告人、审核人等，点击“确定试验翻开待分析图像快捷按钮，在弹出的对话框中找到2.4中保存的pwk文件，点击翻开即可进入分析。工作图像的分析“图像”——“反视或直接点击快捷按钮 ——依据斑点数的多少点击上下箭头选取适宜的模板如4×6，再点击右侧“显示模板按钮 如需不同尺寸的模板框可选“其ctrl+方向键”)使得全部斑点刚好都在选框内，框好点击快捷按钮“计算” ,在弹出对话框中选“yes，软件将自动进展计算，计算完毕按以以以以下图样式将原始图像、工作图像、线性图和数据四个图表显示。5四、试验结果评价1、试验亮度标准试验亮度查看方法：3.1“试验”——“重raw——消灭Raw对话框，单击“范围压缩”在最小值为“0”的状况下，最大值则代表试验亮度水平特别状况、4。试验亮度水平推断标准由于CCD有本底的电子噪音，当试验结果的亮度水平低于502、校准品线性标准校准品线性的查看方法：在工作图像分析完成后，“线性”窗口上方会显示：R=X.X〔如图5，R即代表校准品线性；校准品线性的评价标准线性的好坏反响了校准品亮度与浓度的对应关系，R值越接近于1R>0.99〔特别状况5。五、试验操作常见问题1：提示无法检测到加密狗处理建议：重安装加密狗驱动。点击图标所示时，需选择驱动类型：

文件进展加密狗安装，消灭如以以以以下图66USBUSBUSB装。2：CCD状况分析：内存使用率高，造成读取CCD图像时消灭的假死现象处理建议：请勿重启动或强行关机，多急躁等候1～2分钟，内存读取正常后，会弹出提示框，可进展后续操作特别状况3：背景消退后，仍未看到明显的样本点状况分析：1、设备长时间未使用，造本钱底电荷较多未能够去除；〔1〕荷的效果；〔2〕依据查看试验亮度的方法，调出“范围压缩”对话框，降低最大值数值，直至能够清楚看到样本点，重保存图片进展分析。2、在上述两种方法调整仍未见样本时，可能消灭了试验操作错误〔抗体添加挨次错误或漏加抗体等造成的无发光结果，请回想试验过程，并打算试验重做。4：试验亮度偏低试验图像处理后，亮度水平达不到标准〔图：7：22〔亮度特别〕98〔亮度正常〕1、可能缘由及解决方法：A．25℃；溶液保温；B、由于晾干温度或湿度问题造成的晾干不充分；建议：晾干温度保证在28-30℃，湿度不超过65%，假设温度难以保证，可适当延长晾干时间，以膜完全干透为准；C、移液器或枪头问题造成抗体配置比例偏差大；建议：1、移液器定期校准；2、使用进口枪头；D．反响器皿或其它污染造成抗体效价降低：建议：12、试验工作液当天配置当天使用；3、检查排解试验室是否存在其它有机气体污染；E．试验用水不合格，存在污染：建议：定期对净水器进展检查，清洗、消毒储水桶，使用合格用水。特别状况5：校准品点样挨次错误当试验人员由于点样不慎，造成如以以以以下图的结果时：8〔左239〔下〕〔左下〕修改后先依据正常流程计算结果，分析完毕后再进展调整。操作步骤：点击“工作图像”的标题栏处激活相关菜单功能，点击A2，A13列。填写完毕后点击“确定yes会弹出“操作成功”按“OKA3A2。再9第五局部工程应用介绍一、临床应用1、临床应用价值基于不同类型肿瘤和个体细胞特别增殖度的差异，血清TK1浓度测验真实评估细胞特别增殖病变的进展；通过对肿瘤细胞增殖度水平检测，进展肿瘤患者预后评估；提示康复期患者癌细胞增殖特别变化，推想复发风险。动态监测手术及放化疗期间肿瘤细胞增殖速度状态的变化，为个体化治疗方案制定供给重要信息；2、临床跟踪方法及评估标准〔1〕手术+化疗监控方案治疗方案治疗方案样本采集时间选择1关心化疗2术后〔放疗后〕化疗3113614-6姑息性化化疗间歇期，下个疗程开头前1天；④治疗疗完毕后13〔2〕手术+放疗+化疗监控方案治疗方案治疗方案样本采集时间选择11手术前放疗〔或天；③放疗完毕后，手术前1天；④放化疗联合〕 手术后1个月；⑤手术后3个月；⑥2手术后放疗〔或天；③第213放化疗联合〕 疗程开头前1天；⑤第4疗程开头前一天；3只进展放疗〔或天；③放疗间歇期下个疗程开头前1放化疗联合〕 天；④治疗完毕后1个月；⑤治疗结36手术治疗评估标准A1个月血清TK150%左右；B、术后3-6个月，血清TK1水平接近安康人平均水平〔0.5pM/；C、长期〔术前及术后3-6个月〕维持在低水平0.5pM/。化疗效果评估标准ATK1〔50%左右，视不同肿瘤血清TK1半衰期差异有变化；B、治疗后三个月，血清 TK1水平接近并稳定在安康人平均水平〔0.5pM/；C、在持续治疗过程中，未观看到血清TK1二、体检应用1、体检应用价值早期觉察存在身体内部的细胞特别增殖状况TK1<2.0PM/LTK1<2.0PM/LTK1>2.0PM/L